论文部分内容阅读
目的： 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因具有多向分化潜能、免疫调控和自我复制等特点，临床上已应用于脊髓损伤、糖尿病并发症以及自身免疫系统疾病的治疗。第一部分通过脐带组织块原代培养的方法获得间充质干细胞，并鉴定该细胞的生物学性状。第二部分纯化兔间变表皮鳞癌(VX2)瘤株并接种于新西兰大白兔后腿，研究VX2肿瘤的生长状态，并制备VX2组织悬浊液，为接下来实验做准备。第三部分利用VX2组织块在CT引导下建立肺癌模型，研究脐带间充质干细胞对化疗药物所致胃肠道损伤、骨髓抑制、肝肾脏以及心肌损害的影响，为综合治疗肿瘤、减轻化疗副反应提供更为有效的方法。 方法： 第一部分：将脐带剥除动静脉及结缔组织并剪碎后直接放入含优级胎牛血清(Characterized FBS)的1640培养基中培养，镜下观察细胞的生长形态并绘制其生长曲线，利用Oil-Red-O、Alizarin Reds染色判定脐带间充质干细胞具有分化为脂肪细胞和成骨细胞的能力。第二部分：将VX2肿瘤组织块分离、培养并纯化，将纯化后的VX2细胞接种至新西兰大白兔左后腿肌肉内，接种后3周(肿瘤长至2.0cm×1.5cm大小时)将兔处死，取出瘤体并剔除周围的坏死组织及结缔组织，保留新鲜鱼肉样组织，将新鲜鱼肉样组织充分剪碎，分别通过30目和20目的筛网后收集20目筛网上组织块，将肿瘤组织与1640培养液、30％的泊罗沙姆407凝胶(P407凝胶)及双抗混合于50ml的试管中，保存于4℃冰箱内以备下一步实验使用。第三部分：VX2组织悬液按比例分配成50份，每一份约1ml，肿瘤组织块含量为1块/ml。将48只新西兰大白兔分别建立VX2肺癌模型，随机分为对照组(NS组)10只、顺铂组19只、顺铂+MSCs组19只。3组分别于接种后7天开始，NS组给予等量生理盐水，顺铂组注射顺铂4.4mg/Kg，顺铂+MSCs组注射顺铂第2天给予MSCs(1×106个/次)，均耳缘静脉注射给药，7天给药一次(为一周期)，连用3个周期。3周期结束后检测大白兔WBC、RBC、Hb、PLT、ALT、AST、ALP、血尿素氮及肌酐的含量，以及心肌TnI和BNP的含量，同时留取大白兔的心脏、肺脏、肝脏、肾脏以及部分小肠，待作病理切片HE染色。 结果： 第一部分：按照脐带组织块原代培养的方法培养间充质干细胞，每厘米的脐带可获得1×106个成纤维样细胞，分离12cm长的脐带培养3周即可获得1×108个成纤维样细胞，经过体外诱导实验证实这些细胞具有分化为脂肪和成骨细胞的能力。第二部分：VX2组织块经过纯化后成功接种到大白兔左后腿肌肉内，并生长出肿瘤，取出瘤体制备成VX2组织块凝胶悬液。第三部分：接种VX2组织悬液的大白兔胸部CT检查证实右侧肺内均出现肿瘤，VX2肿瘤模型建立成功率为100%。NS组和顺铂+MSCs组大白兔饮食及精神状态明显好于顺铂组。治疗第21天时，NS组、顺铂组和顺铂+MSCs组大白兔平均体重分别为2.65±0.46Kg、1.25±0.48Kg、1.81±0.62Kg。顺铂组、顺铂+MSCs组分别与NS组相比，大白兔的体重均减轻，差异具有统计学意义(P值分别为0.0036、0.0084)。顺铂组与顺铂+MSCs组相比，大白兔体重减轻更明显，具有显著性差异(P＜0.05)。顺铂+MSCs组与顺铂组相比，WBC、RBC、Hb和PLT的含量均明显升高，ALT、AST、ALP、尿素氮及肌酐含量均出现不同程度降低，TnI和BNP含量明显减少，两组相比差异均具有统计学意义(P＜0.05)。肉眼观察顺铂+MSCs组胃肠道颜色红润，有光泽，而顺铂组大白兔的胃肠道苍白，弹性较差；病理切片HE染色结果，NS组肠道黏膜光滑，小肠微绒毛完整，顺铂组肠道黏膜出现不同程度的断裂、脱落、充血以及缺损，顺铂+MSCs组肠道黏膜较完整、光滑。肉眼观察NS组、顺铂组和顺铂+MSCs组的肝脏和心脏未见明显差异，顺铂组肾脏与NS组相比略显苍白，而顺铂+MSCs组肾脏与顺铂组相比较为红润；两组病理HE染色镜下发现，顺铂组肝脏内有间质炎细胞浸润、肝血窦扩张充血及局灶钙化出现，肾脏可观察到肾小球血管充盈中性粒细胞增多、肾小管水肿及间充质充血，而心肌排列紊乱、胞浆不均匀、横纹疏松并发现空泡化现象；顺铂+MSCs组部分实验兔肝组织出现间质炎细胞浸润及肝血窦扩张充血，肾组织则出现不同程度的肾小管水肿及间充质充血，其心肌可见横纹疏松、心肌排列相对整齐。 结论： 1.利用脐带组织块原代培养的方法，可直接在富含血小板血浆的培养基中培养，操作过程简单，与酶消化法相比更易出现细胞克隆，并且可以避免动物血清导致的过敏反应以及免疫排斥现象，从而提高安全性。 2.通过对VX2肿瘤组织块的培养传代，成功纯化了VX2肿瘤细胞株，并证实该细胞具有肿瘤细胞无限增殖的特点。利用P407凝胶低温液态常温胶状的特点制备了1mm3大小VX2肿瘤组织块悬液，为下一步的研究提供了保障。 3.该模型在CT引导下建立，利用P407凝胶作为肿瘤组织块的载体，其操作方法较以往简便，避免了悬液外溢引起肿瘤的种植转移，还可减少并发症的发生，同时可在肺内形成体积较为均一的肿瘤，为接下来实验提供可行方案。 4.利用MSCs的干预治疗发现，该细胞可以修复和保护化疗药物所致的胃肠道损害，还可改善肝、肾脏以及心肌的损害，减轻骨髓抑制作用，为将来综合治疗肿瘤减轻化疗副反应提供更为有效的方法。