PhoP/PhoQ系统是鼠伤寒沙门氏菌毒力调控中最关键的二元调控系统之一。已知的可以激活PhoP/PhoQ系统的信号包括低浓度的镁离子,酸性pH,以及阳离子抗菌多肽(cAMP) (1,2)。PhoP/PhoQ系统被激活后,可以调节100多个基因的表达(3),同时PhoP/PhoQ系统对一些其它的二元调控系统,如SsrA/SsrB(4), PmrA/PmrB(5)和RstA/RstB(6)也有调控作用。有研究表明,沙门氏菌中RstB (RstA/RstB系统中的组氨酸激酶)可以与PhoQ相互作用从而激活PhoP/PhoQ(7)。另外,RstA也可以在低浓度镁离子或酸性pH条件下被PhoP/PhoQ系统激活(8)。这些研究说明在关键调控系统PhoP/PhoQ和了解较少的RstA/RstB系统之间可能存在着关联和互作。通过系统生物学方法研究PhoP/PhoQ系统的工作很多,而对RstA/RstB系统调控网络的系统性研究目前还没有报道。为了更好地解析RstA/RstB系统以及RstA/RstB 与 PhoP/PhoQ之间的关系,我们采用了一个已知的PhoP/PhoQ和RstA/RstB的激活条件培养细菌(低浓度镁离子)(8-11),系统地分析和比较了鼠伤寒沙门氏菌中RstB敲除和PhoP-PhoQ敲除引起的蛋白质组变化。我们所采用的主要技术方法是基于稳定同位素的双甲基化标记策略和串联质谱技术的定量蛋白质组学分析,结合生物信息学分析,同时针对部分结果进行了进一步的生物学功能探索。1. RstA/RstB系统的蛋白质组学研究1.1实验策略和蛋白质组学数据总览首先,我们构建了ArstB突变菌株并检测了它的生长情况。当细菌在高浓度镁离子(10 mM)或低浓度镁离子(10μM)条件下生长9小时的时候,我们发现ArstB菌株与野生型的菌株生长相似,表明镁离子浓度并不影响ArstB菌株的生长。蛋白质组学分析的主要流程是：将ArstB和野生型菌株在低浓度镁离子条件下培养9小时后提取蛋白,蛋白经过胰蛋白酶酶解为肽段后,通过稳定同位素双甲基化反应分别标记为“轻”和“重”(野生型样品标为“轻”,ArstB突变株样品标为“重”)。然后,标记的肽段等比例混合,经过SCX分为5个组分,最后分别进行串联质谱分析。每组定量蛋白质组学实验都进行三次生物学重复。一共定量到2297个蛋白,其中有1587个蛋白(约69%)在三次重复中都检测到了(图1A)。我们对这些共有的蛋白进行了相关性分析。三组生物学重复的皮尔逊相关系数分别为0.801,0.623和0.666,表明三组实验的重复性较好。为了确定显著变化蛋白的阈值,我们将蛋白比值做了log2处理,然后值进行高斯分布拟合分析。基于平均值和标准差,我们将上下调的临界值定为平均值±1.96 SD(12),即蛋白表达值为值为≤0.73和≥1.48。这样,ΔrstB/WT组实验中检测到的2297个蛋白中有6.92%(97个上调,62个下调)的蛋白发生了显著的变化(图1B)。结果显示,在低浓度镁离子条件下,RstA/RstB系统抑制的蛋白数目比激活的蛋白多。1.2生物信息学分析通过DAVID网站的分析(13,14),定量到的2297个蛋白匹配到了80个代谢通路。在这些通路中,我们发现只有一个信号通路Biosynthesis of siderophore nonribosomal peptides group, (stm01053)勺6个蛋白中,5个都发生了下调。统计学富集检验(statistical enrichment test’)分析显示(15),有6个生物学过程(BP),6个分子功能(MF)和1个细胞组分(CC) overrepresented (p<0.05),而有3个MF underrepresented另外,统计学比例过高检验(statistical overrepresentationtest’)分析显示,有6个BP,3个MF和8个CC overrepresented (表 2.8-2.10)。但是在BP, MF和CC分析时,每组有一个未分类的组分表现为underrepresented(p<0.05)(表2.8-2.10)。在低浓度镁离子条件下,两个在ArstB菌株中上调最明显的蛋白是Udp(uridine phosphorylase尿苷磷酸化酶)和Cdd (cytidine deaminase胞苷脱氨酶),均上调约9倍。同时这两个蛋白在AphoPQ组中并没有发生显著变化。维电泳分析结果也显示RstB敲除会导致Udp和Cdd表达水平的显著上升(图2 A,B)。低浓度镁离子条件下的ArstB菌株样品的二维电泳的胶图上,点“1”和“2”被鉴定为Udp和Cdd蛋白(图2B)。然而,在相应的WT菌株的样品胶图上的该位置,对应的蛋白点基本看不到(图2A)。而且,胶图上这两个蛋白的位置与它们的分子量大小和等电点相符,说明它们是以蛋白的完整形式存在的。Udp和Cdd蛋白都在嘧啶代谢过程中发挥了重要的作用。Cdd参与了Cytidine 和 Deoxycytidine的脱氨基过程(图2C)。Udp催化可逆的尿嘧啶核苷和脱氧尿嘧啶核苷到尿嘧啶和核糖-1-磷酸的磷酸切割反应。核糖-1-磷酸转化为核糖-5磷酸,核糖-5-磷酸又能促进戊糖磷酸循环反应(图2C)。因此,Udp可以维持ATP能量来源,也在细菌清除胞内多余的尿苷以维持正常的尿苷浓度的过程中发挥着关键作用。几乎所有的生物细胞中尿苷的生理浓度都在4-6 μM(16),当尿苷浓度升高时,嘧啶的从头合成途径将被阻断(16)。蛋白质组学数据显示低浓度镁离子条件下,蛋白Udp和Cdd受被RstA/RstB系统抑制(RstB被敲除时,Udp和Cdd显著增加)。这表明RstA/RstB可能在平衡尿苷浓度和为戊糖磷酸循环提供中间产物的过程中发挥着重要作用。1.4 RstA/RstB对铁离子获取的调控作用肠杆菌素(Enterobactin)是一种高亲和的铁载体蛋白,被微生物用来获取铁离子。我们的结果显示铁载体蛋白合成中必需的肠杆菌素蛋白(EntA, EntB, EntE, EntF, MenF)在△rstB菌株中显著下调,而在△phoPQ菌株中保持不变。但是,另外两个铁转运蛋白FeoA和FeoB却在△rstB中上调,在△phoPQ中不变。为了证明铁载体蛋白(EntA, EntB, EntE, EntF)口铁转运蛋白(Ferrous iron transport protein A and B, FeoA and FeoB)确实是以不同的方式被调控的,我们使用了另外一种定量蛋白质组的方法—PRM—来监测△rstB和WT菌株中这些蛋白相对含量的变化。结果显示,PRM的定量结果与双甲基化的定量结果一致(图3A-D)。此外,qPCR的分析也显示,与WT菌株相比,entA, entB, entE 和 entF 在ΔrstB菌株中下降了0.5-0.6倍,而feoA和feoB基因上升了1.6-1.7倍。这些结果说明对铁离子获取相关蛋白的调控是在基因转录水平进行的。金属离子的获取对细菌的生长和繁殖具有极其重要的作用。铁离子在环境中的含量较高,是所有微生物生命活动过程中的必需元素。前人的研究表明,在沙门氏菌中,二价亚铁离子(Fe2+)和三价铁离子(Fe3+)是通过不同途径获取的,亚铁离子是通过feo系统转运的(17),而三价铁离子则是通过肠杆菌素获取的(18-20)。即使通常情况下铁离子在宿主体内环境中的含量特别低(因为游离的铁离子具有毒性),病原菌也能够利用肠杆菌素从宿主体内抢夺铁离子。现在公认PhoP/PhoQ激活时会引起几种镁离子转运蛋白的上调(MgtA, MgtB) (11,21)本研究又显示RstA/RstB系统对铁离子的获取具有调控作用。因为在Biosynthesis of the siderophore nonribosomal peptides pathway (stm01053)通路中,△rstB显示出与△phoPQ相反的效果,而且在一篇最近的来自于本课题组的蛋白质组学文章显示,PhoP/PhoQ可能抑制铁获取相关蛋白的表达(22),因此,很有可能是,在铁缺失环境中,为了确保细菌能够生存,RstB蛋白很有可能通过增加肠杆菌素表达而增加摄入的铁离子的量。1.5 RstA/RstB动性和入侵的调控作用在ΔrstB/WT组数据中,跨膜蛋白F1hA(鞭毛合成蛋白)下调约0.7倍,另一个趋化性相关的蛋白Mg1B(半乳糖／甲基半乳糖苷ABC转运子底物结合蛋白)下调了约0.66倍。为了测试ArstB和△phoPQ突变对细菌运动性的影响,我们使用了低浓度镁离子条件下的半固体琼脂平板进行细菌运动性检测。实验结果显示,ArstB菌株的运动性明显降低,而△phoPQ菌株的运动性与WT菌株相似(图4A,B)。运动性是细菌入侵感染过程的起始步骤(23,24),那么,ArstB菌株显示出的低运动性会造成感染能力的降低吗?我们用ArstB菌株感染HeLa细胞实验来检测其入侵和感染能力的变化。入侵和感染实验结果显示,与WT菌株相比,ArstB菌株的感染能力降低了3倍(图4C)。由于Udp在ArstB菌株中明显上调,接着我们又测试了Udp蛋白与ArstB菌株感染能力降低有没有什么联系。我们构建了ΔrstBΔUdp双突变菌株,对其感染能力进行了测试,发现双突变菌株的感染能力与ArstB菌株类似。因此,Udp不太可能与细菌的感染有关。由于感染相关的蛋白通常丰度比较低,没有出现在我们的定量蛋白质组学的结果中,因此我们使用qPCR技术对这些感染相关的基因进行定量(图4D)。结果显示与WT菌株相比,ArstB菌株中很多感染相关的基因,比如invA, invF, invG 和 orgB (25)都发生了下调。综上所述,RstA/RstB二元调控系统确实可以通过调控相关的基因而对感染进行调控。2. PhoP/PhoQ系统的蛋白质组学分析2.1.实验策略和蛋白质组学数据总览细菌生长曲线实验显示,当培养基中的镁离子浓度在10 mM时,ΔphoPQ菌株的生长曲线与野生型菌株相似。而当镁离子浓度维持在10μM时,ΔphoPQ菌株的生长则与野生型差异很大,表现为从6.5小时起生长减缓。这个结果表明AphoPQ菌株对低浓度镁离子条件较为敏感。蛋白质组学分析流程与前述相似,低浓度镁离子条件下培养的AphoPQ菌株和野生型菌株经过裂解、蛋白提取、酶解和标记等步骤处理后,进行串联质谱检测。三个生物学重复实验共定量到了2288个蛋白,其中1844个(约80%)是个重复中共有的(图5A)。这些共有的蛋白经过相关性分析,计算出的皮尔逊相关系数分别为0.886,0.898和0.870,显示了良好的重复性。高斯分布拟合分析之后,基于均值和标准差确定的上下调的临界值(平均值±1.96 SD)分别定为≤0.34和≥2.51。这样就有14.9%的蛋白(82个上调,259个下调)发生了显著的变化(图5B)。2.2生物信息学分析通过DAVID网站的分析,定量到的2288个蛋白和431变化的蛋白分别匹配到了85个和10个代谢通路中。统计学富集检验(statistical enrichment test)分析显示,有3个生物学过程(BP)和2个分子功能(MF)变化比例高于预期(overrepresented) (p<0.5),而有1个BP和1个MF则低于预期(underrepresented) 。另外,统计学比例过高检验(statistical overrepresentation test)分析显示,有20个BP,6个MF和15个CC比例高于预期,几乎没有低于预期的类别(表3.1-3.3)。3. RstA/RstB 和 PhoP/PhoQ系统调控的比较分析3.1两组定量蛋白质组学数据总览ΔrstB/WT组和ΔphoPQ/WT组定量蛋白质组学数据中,显著变化的那些蛋白可能是受RstA/RstB或PhoP/PhoQ系统直接或间接调控的蛋白。通过高斯分布分析,确定了两组实验蛋白变化的临界值ΔrstB/WT组上下调的临界值定为1.48和0.73,ΔphoPQ/WT组的定为2.51和0.34。基于该临界值,ΔrstB/WT组和ΔphoPQ/WT组中变化的蛋白分别有6.92%(97个蛋白上调,62个下调)(图1B)和14.9%(82个上调,259下调)(图5B)。我们的数据显示,在低浓度镁离子条件下,PhoP/PhoQ系统激活的蛋白是RstA/RstB系统的4倍(ΔphoPQ/WT组中下调的有259个蛋白,而ΔrstB/WT组中只有62个)。3.2比较RstA/RstB 和 PhoP/PhoQ的调控蛋白为了找出被RstA/RstB 和 PhoP/PhoQ系统调控的代谢通路,我们将定量到的蛋白提交到DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf.gov/home.js)数据库进行搜索。结果发现ΔrstB/WT和ΔphoPQ/WT组的蛋白共匹配到80和85个代谢通路(p<0.05),两组中共同的通路有80个。我们还手动计算了每个通路中匹配到的蛋白的平均比值(图6A)。在这些相同的通路中,我们发现虽然△phoPQ的影响比△rstB更大,但在NRPS (siderophore nonribosomal peptides)合成这一条通路(stm01053)上,ArstB展示出与AphoPQ完全相反的调控作用(图6B)。为了找出哪些生物学过程在RstB和PhoP-Q突变后发生了明显的变化,我们把发生变化的蛋白(上调和下调的蛋白)提交到PANTHER网站做统计学富集测试。PANTHER (全称Protein Analysis Through Evolutionary Relationships,网址http://www.pantherdb.org/)提供了一个将提交的蛋白列表与参考蛋白库相比较的工具,通过计算实际观测的蛋白数目与预期蛋白数目的差异来判断信号通路是否得到富集(p值小于0.05)。这个检测可以确定待测列表中的蛋白在某个生物学过程的变化是高于或者低于预期。注释数据的结果显示,在ArstB/WT和AphoPQ/WT两组被共同富集到的变化的蛋白中,6个生物学过程(BP),包括生物合成过程(G0：0043604),细胞酰胺代谢过程(GO：0043603),肽段合成过程(GO：0043043),肽段代谢过程(GO：0006518),翻译(GO：0006412),初级代谢过程(GO：0044238)表现为高于预期,但是存在一个未分类的蛋白表现为低于预期(表4.1)；分析分子功能(MF)时发现,变化的蛋白匹配到3个分子功能类别——分子功能(GO：0003674),核糖体结构组成(G0：0003735),分子结构活性(G0：0005198)且均高于预期,1个分子功能(未分类)则显示为低于预期(表4.2)；胞内定位分析(CC)结果显示,在这些变化的蛋白中,8个被检测出明显高于预期的类别,分别是核糖体(GO：0005840),核糖核蛋白复合体(GO：0030529),无膜结构的细胞器(GO：0043232),胞内细胞器(G0：0043229),细胞质(GO：0044444),非膜结构细胞器(GO：0043228),细胞器(G0：0043226),大分子复合体(GO：0032991),同样存在一个未分类的信号通路在ΔrstB/WT 和 PhoP-Q/WT组都低于预期(表4.3)。这些结果揭示出R stA/RstB系统的调控与PhoP/PhoQ的调控有某种程度的重叠,但PhoP/PhoQ系统影响着更多的生物学过程。很明显,PhoP/PhoQ系统确实是个“关键调控系统”从以上的的生物信息学分析可以看出,似乎所有出现在RstA组的受调控蛋白所在的类别都在PhoP组中出现了。但是还不清楚受调控的蛋白中共同的有哪些?有没有在两组中变化不同的蛋白?为了回答这些问题,同时区分受RstA调控的和PhoP调控的蛋白,我们系统地比较了二者(图6C-E)。两组结果中,8个蛋白是共同的上调的蛋白(图6C),8个蛋白表现为共同下(图6D)。然而,有15个在ΔrstB/WT中上调的蛋白在ΔphoPQ/WT组中下调了(图6E),另外有74个在ΔrstB/WT上调的蛋白和54个下调的蛋白在ΔphoPQ/WT组中没有发生变化(图6F)。在这8个共同的上调蛋白中,有4个核糖体蛋白(RpmB, RpsT, RpsO, RplY),2个初级代谢相关的蛋白(FabZ, TtcA). FabZ蛋白是一个脂肪酸合成中的脱氢酶(26),而tRNA和氧敏感的铁硫簇上的32位的半胱氨酸的硫醇化过程中则需要TtcA(27)。这些结果说明RstA/RstB 和 PhoP/PhoQ系统都抑制了肽段合成和一些代谢过程。在8个两组中都下调的蛋白中(图3D),PagK和OmpC这两个蛋白是已知的受PhoP激活的蛋白(21)。因此,RstA/RstB系统确实可以激活PhoP/PhoQ调控网络的部分蛋白。在ΔrstB/WT中上调,同时在ΔphoPQ/WT组中下调的蛋白中(图6E),PagP是PhoP激活蛋白,在沙门氏菌的脂质A合成中发挥作用(28)。BaeS和SsrA (SpiR)分别是二元调控系统BaeS/BaeR 和 SsrA/SsrB的组氨酸激酶(29),(30),其中,SsrA/SsrB系统是受PhoP/PhoQ调控的。因此,RstA/RstB可能在某些方面与PhoP/PhoQ调控起着平衡的作用。最后,我们还注意到有些蛋白在ΔrstB/WT中发生上调或者下调,但是在ΔphoPQ/WT中没有变化(图6F)。其中包括两个在ΔrstB/WT中上调最明显的两个蛋白(都上调了约9倍),Udp(尿苷磷酸化酶)和Cdd(胞苷脱氨酶),还有7个在铁获取过程中发挥作用的蛋白(EntA, EntB, EntE, EntF, MenF, FeoA 和 FeoB)及2个运动性相关的蛋白(FhlA,MgLB)。3.3.结论总之,在本研究中,我们通过基于双甲基化的定量蛋白质组学方法对RstA/RstB 和 PhoP/PhoQ系统调控下的变化进行了比较(图7)。我们发现,虽然RstA/RstB 和 PhoP/PhoQ两个系统都会调控一些共同的蛋白和代谢,但PhoP/PhoQ系统的调控网络却更加广泛。只在铁载体NRPS合成这一个通路(stm01053)中,△rstB菌株显示了与ΔphoPQ菌株相反的作用。我们的数据也显示,除了与PhoP/PhoQ系统相关的调控外,RstA/RstB也单独在嘧啶代谢、铁离子获取、细菌的运动和入侵的调控中发挥了重要的作用。我们的研究为解析RstA/RstB功能,以及RstA/RstB 与 PhoP/PhoQ之间的互作(cross-tal k)和协同调控(coordinated regulation)提供了新的启示,并能帮助我们更深入地揭示沙门氏菌的致病机理。