【摘 要】
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背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球癌症相关死亡的第三大原因,肝脏代谢的改变有助于非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver Disease,NAFLD）、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis,NASH）和HCC的起始和进展。细胞周期阻滞同样影响HCC的发生发展。因此,肿瘤代谢和细胞周期研
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背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球癌症相关死亡的第三大原因,肝脏代谢的改变有助于非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver Disease,NAFLD）、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis,NASH）和HCC的起始和进展。细胞周期阻滞同样影响HCC的发生发展。因此,肿瘤代谢和细胞周期研究成为探索HCC治疗靶点的重要途径。E3连接酶通过泛素化修饰广泛存在于肿瘤细胞的代谢通路,影响肿瘤的发生发展。我们希望筛选出在谷氨酰胺饥饿应激条件下促进肝癌细胞继续存活的关键E3连接酶,探索其在肝癌中的具体功能和作用机制,明确其是否影响肝癌细胞的代谢。方法:通过蛋白组学数据以及实验验证,筛选响应谷氨酰胺饥饿刺激表达量变化明显的E3连接酶。通过核质分离实验以及免疫荧光实验,确定该蛋白质在肝癌细胞中的亚细胞定位。利用网站预测以及蛋白质组学数据,分析查找E3连接酶的转录因子,并实验验证该转录因子是否调控E3连接酶的表达。利用生物信息学数据检索,探究E3连接酶在肝癌组织中的表达以及预后情况。通过敲低E3连接酶,利用细胞生长曲线实验和克隆形成实验,探究其对肝癌细胞增殖能力的影响。通过敲低E3连接酶,探索其对细胞周期和肿瘤代谢的影响。结果:通过蛋白组学筛选,发现三元基序家族蛋白15（tripartite motif-containing protein 15,TRIM15）响应谷氨酰胺饥饿刺激蛋白质表达上调。Western blot和QRT-PCR进行验证,证实TRIM15响应谷氨酰胺饥饿刺激在蛋白质和mRNA表达上调明显。TRIM15在多种应激条件下只响应谷氨酰胺饥饿刺激,我们推测TRIM15参与谷氨酰胺代谢调控。核质分离和免疫荧光实验证实TRIM15在细胞核和细胞质中均有定位,但主要定位于细胞核。实验证明,在谷氨酰胺饥饿刺激条件下,干扰素调节因子2（interferon regulatory factor 2,IRF2）作为转录因子调控TRIM15的转录,使TRIM15在mRNA和蛋白质水平表达上调。设计短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）在肝癌细胞系中对TRIM15进行敲低,敲低TRIM15后,谷氨酰胺代谢通路中谷氨酸脱氢酶1（glutamate dehydrogenase 1,GLUD1）、谷氨酸草酰乙酸转氨酶 2（glutamic-oxaloacetic transaminase 2,GOT2）、磷酸丝氨酸转氨酶 1（phosphoserine aminotransferase 1,PSAT1）、苹果酸脱氢酶 1（malate dehydrogenase 1,MDH1）四种代谢酶的表达水平均显著下调。这些研究结果证明TRIM15敲低强烈抑制谷氨酰胺分解代谢。生物信息学分析显示,TRIM15在肝细胞癌中的表达水平高于正常组织,和肝细胞癌的不良预后相关,推测TRIM15在肝细胞癌中发挥促进癌症的作用。在肝癌细胞系中对TRIM15进行敲低,敲低TRIM15后,细胞生长曲线测定和克隆形成结果显示,细胞增殖受到显著抑制（P＜0.05）;而Western印迹检测在敲低TRIM15后,细胞周期蛋白A（cyclinA）、周期蛋白依赖性蛋白激酶2（cyclin-dependent kinase 2,CDK2）、Rb、P-Rb、E2F 转录因子 1（E2F transcription factor 1,E2F1）表达下调,而 CDK 抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI）p16、p21、p27表达显著上调。流式细胞术检测细胞周期显示,敲低TRIM15使细胞阻滞在G0/G1期（P＜0.05）;这些结果证明TRIM15敲低抑制肝癌细胞生长,诱导肝癌细胞周期受阻于G0/G1期。因此我们得出结论,TRIM15一方面通过调控谷氨酰胺代谢酶的表达水平满足肿瘤细胞对谷氨酰胺的高需求,另一方面作为癌基因促进肝癌细胞的生长和存活。因此,TRIM15通过调控谷氨酰胺分解代谢和细胞周期发挥功能,能够作为潜在的HCC治疗靶点。
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