[目的]： 本研究在前期工作的基础上,结合近年文献报道,利用GM耳毒性离体损伤模型,采用原位荧光、免疫荧光等方法,主要从线粒体凋亡信号转导途径角度进一步探讨耳聋左慈丸及有效拆方(熟地加泽泻药对、泽泻单味)拮抗GM耳毒性的机制,同时进行熟地加泽泻药对剂量配比优化实验,以及观察泽泻单味的活性成分泽泻醇A、泽泻醇B拮抗GM耳毒性的作用。为中医药防治药物中毒性聋提供基础实验依据。 [方法]： 1、复制耳蜗螺旋器离体培养模型,采用原位荧光、免疫荧光染色等方法观察GM致毛细胞凋亡相关因子-Caspase-9、-3蛋白酶活性及Cyt C、Bcl-2、Bax蛋白表达的变化；观察耳聋左慈丸全方、熟地加泽泻药对、泽泻单味对上述各项指标的影响。 2、采用基线等比增减设计方法对有效拆方熟地加泽泻药对进行剂量配比优化实验,采用荧光染色法观察毛细胞表皮板及纤毛形态、毛细胞排列情况并进行毛细胞计数,观察不同剂量配比下熟地加泽泻药对对GM损伤毛细胞存活率的影响。 3、采用荧光染色及毛细胞计数法观察泽泻单味的两个主要活性成分泽泻醇A、泽泻醇B拮抗GM耳毒性、提高毛细胞存活率的量效关系；观察泽泻醇A、B在最佳有效浓度对GM损伤毛细胞蛋白酶Caspase-3活性的影响。 [结果]： 1、与正常对照组比较,0.3mmol GM能够引起与线粒体凋亡途径相关的Caspase-9、-3酶活性明显增强、凋亡调节因子Bcl-2、Bax蛋白表达显著增高,Cyt C蛋白量有增高趋势。与模型组比较,熟地加泽泻药对、泽泻单味均能明显抑制Caspase-9、-3酶活性,明显上调Bcl-2蛋白表达,对Cyt C及Bax蛋白表达有下调趋势。耳聋左慈丸对Caspase-9酶活性有显著抑制作用,对Caspase-3酶活性及Cyt C、Bcl-2、Bax蛋白表达无明显调节作用。 2、毛细胞计数结果显示,0.3mmol GM处理24h后,毛细胞存活率明显下降,在40％左右,排列比较紊乱。与模型组比较,补肾药对中熟地与泽泻在8/1、8/3、5/3、2/3比例下毛细胞存活率均明显上升,各组间没有显著性差异。 3、泽泻活性成分泽泻醇A、B在10～30μmol范围内均能有效拮抗GM对耳蜗毛细胞的损伤、提高毛细胞存活率,其最佳有效浓度均为20μmol。此浓度下,泽泻醇A、B能够明显抑制GM引起的毛细胞Caspase-3蛋白酶激活。泽泻醇B的促进毛细胞存活作用及抗凋亡作用都明显高于泽泻醇A。 [结论]： 1、GM耳毒性作用的部分分子机制与线粒体凋亡信号转导途径异常有关。熟地加泽泻药对、泽泻单味均能通过抑制GM诱导的毛细胞Caspase-9、-3蛋白酶激活,上调Bcl-2蛋白表达,从而纠正GM线粒体凋亡信号转导途径的异常变化,拮抗GM对毛细胞的损伤作用。 2、熟地与泽泻组成的补肾药对作用于GM损伤模型,对毛细胞显示出保护作用。熟地与泽泻两味药在各个配比下均能有效提高毛细胞存活率。原方中所载熟地与泽泻的配比关系(8/3)具有合理性,且配比存在有效比例范围。熟地与泽泻的不同配比与其效应的关系是非线性的。 3、泽泻醇A、B均表现出有效拮抗GM耳毒性的作用。泽泻醇B促进毛细胞存活作用及抗凋亡作用都明显高于泽泻醇A。