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青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是世界十大植物病原细菌之一，因其寄主种类多、分布范围广且具有丰富的遗传多样性而被认为是一个多变的复合种。青枯雷尔氏菌种下具有丰富的多态性，包括表型多态性、寄生多态性、遗传多态性等，其基因组内部极大的变异可能性是其表现如此多态性的重要原因。烟草作为青枯雷尔氏菌的寄主之一，常受到青枯雷尔氏菌侵染危害。在我国，烟草种植面积广泛，跨越多个地理区域，其生长的气候、生态环境多种多样。而发生青枯病的烟区也较多，近年来，由于环境、气候、种植结构调整等方面的原因，该病的危害范围有逐渐向高纬度高海拔冷凉地区蔓延之势；并且，据报道在酸化区域该病害发生较为严重。但是，具体的非生物因子与菌株遗传进化及多态性的关系仍然不清楚，有待进一步探索。同时，菌株长期在酸环境或冷凉环境中会表现怎样的适应性，其适应性进化过程会有怎样的表型响应及分子机制尚需进行深入研究。
基于此背景，本学位研究论文首先在全国14个种植区选取代表野生型菌株分析了菌株种下遗传多样性及进化情况，并以实验进化(experimental evolution)结合基因组重测序的方法具体分析了青枯雷尔氏菌菌株在实验室条件下适应酸环境和低温环境的过程及可能存在的分子机制，此外，还评估了适应实验菌株的环境适合效应。从自然种群到实验种群，详细阐明了青枯雷尔氏菌菌株的多样性和适应具体非生物因子的分子机制及相关影响。本学位论文的主要研究结果如下：
1明确了全国烟草青枯雷尔氏菌菌株的遗传多样性及系统进化关系，全国烟草青枯病菌具有7个类群，并且发现菌株序列变种的流行、分布与海拔等因子有关
选取了从全国各地区烟草植株上分离的代表菌株107株，采用演化型分类框架中的序列变种分析方法对其进行分类，以分析单一寄主上青枯雷尔氏菌的遗传多样性。基于egl系统发育树可知，全国烟草青枯雷尔氏菌具有序列变种多样性，所有供试菌株可被聚类到8个组群中，分别为序列变种13、14、15、17、34、44、54、55，其中，序列变种55为新归类的组。序列变种的流行与海拔因子具有一定关系，具体来讲，序列变种15和34主要流行于低海拔范围内；序列变种54流行于较高海拔区域。对海拔、温度、土壤pH存在显著差异的西南部生态区和东部生态区的序列变种分布进行统计，结果表明，受不同海拔、温度、土壤pH影响的区域之间序列变种存在显著差异。
对107株代表供试菌株的基因组数据进行分析。基于所有基因组的SNP构建了系统进化树并进行了STRUCTURE分析，结果表明全国烟草青枯病菌可能具有7个类群，大部分同一序列变种的样品在基因组进化树中能聚类在同一分支中，而部分菌株存在杂合情况。同一植烟生态区的菌株分布在不同的遗传结构群中，说明全国菌株在生态区之间存在交叉传播。对菌株中的所有编码基因簇进行阳性选择分析，共计算到628个受到正选择的基因，而根据注释信息和受选择位点情况可知，T3Es、运动性相关基因等致病因子基因受到强烈正选择，说明菌株在适应过程中致病相关基因进化更快。
2通过长期胁迫，获得了适应酸环境/低温环境的青枯雷尔氏菌实验进化菌株，明确了各实验菌株的表型变化情况
分别设置酸和低温两个非生物因子的实验环境对原始菌株CQPS-1进行实验进化，经过长期继代培养后获得单一因子胁迫后的酸适应实验菌株及低温实验菌株。在酸环境(pH4.9的基础培养基)中连续培养1500代后，酸适应实验菌株在酸环境中的适应性显著提升，其生长速率较对照实验菌株增加了1.67倍。在温度胁迫试验中，长期继代培养400d后，Tm20系列实验菌株在20℃震荡培养的条件下整体生长量相较于原始菌株CQPS-1增加1.83倍，相较于对照Tm30系列菌株增加1.26倍，Tm20系列低温实验菌株适应相对低温环境的能力较原始菌株显著增强，与其对照系列菌株相比，虽有增强趋势，但未达到显著水平。
同时，对所有实验菌株表型特性进行了评价，包括所有实验菌株的菌落形态、培养表型、运动性，以及部分菌株的碳源代谢情况。在培养表型及菌落形态方面，长期连续培养后，所有实验菌株均由中心粉红色、白边较宽、流动性强的典型强致病力菌株菌落形态转变为菌落较小、暗红色、白边较窄、流动性差的无致病力菌落形态，此外，有2株低温响应实验菌株(Tm20-2和Tm20-5菌株)在固体平板上出现褐色物质。对所有实验菌株的运动性进行了评价，酸适应实验菌株的运动性显著增强；相较于原始菌株CQPS-1，酸适应实验菌株的运动性晕圈显著增加了1.68倍，而其余所有实验菌株(包括C65系列、Tm20系列、Tm30系列)的运动性均显著降低，分别降低了0.50倍、0.42倍、0.51倍。选取相对低温长期连续培养的3株代表实验菌株(Tm20-2、Tm20-4和Tm20-5)评价了其碳源代谢情况，由AWCD值比较结果可知，低温实验菌株的碳源代谢能力较原始菌株显著提升，其对29种碳源物质的利用率增强。
3基于全基因组重测序的方法明确了酸适应菌株和温度响应菌株的适应性分子机制及相关基因的功能
对不同pH环境中培养的酸实验菌株(5株酸环境的C49菌株和5株对照pH环境的C65菌株)、温度实验菌株(5株低温响应的Tm20系列实验菌株，5株正常温度的对照Tm30系列实验菌株)进行基因组重测序，酸实验菌株共获得23.96Gbp的CleanData，温度实验菌株共获得23.80Gbp的CleanData。
比较分析了C49系列菌株和C65系列菌株之间的变异差异，维恩图结果表明，两个系列的实验菌株中共有的变异基因有127个，而C49系列特有的变异基因有10个，C65系列的特有变异基因有7个。从各菌株基因变异位点情况来看，phcA(基因ID为BC350_10400)、pehR(基因ID为BC350_10115)、spp(基因ID为BC350_11470)可能与菌株适应酸环境及运动性改变有关。采用基因敲除的方法对其中两个基因(spp和pehR基因)分别进行功能验证，明确了信号肽蛋白基因(spp)对菌株菌落形态、正常生长过程、运动性以及对菌株适应酸环境无影响，但在对烟草云烟87的致病力方面具有一定影响；而pehR基因对菌株菌落形态及生长情况的影响较小或几乎无影响，但缺失pehR后菌株运动性下降，且对烟草云烟87的致病力显著降低。结合文献报道，在菌株适应酸环境并发生运动性改变的过程中，主要是phcA和pehR基因在起重要作用。
对Tm20系列和Tm30系列菌株的变异差异基因进行分析，发现两个系列菌株中共有的变异基因有83个，Tm20系列特有的变异基因由8个，Tm30系列特有的基因有5个。但是变异位点比较结果表明，在Tm20系列的5株实验菌株或Tm30系列的5株实验菌株中并未出现共同一致的突变位点，说明在相对低温培养过程中的变异仅为随机变异，目前并未出现明显与适应低温相关的变异基因。此外，还分析了2株Tm20菌株在培养过程中产生褐色这一表型改变的分子机制，由变异位点比较结果推测，该表型变化与tRNA(鸟嘌呤-N1)-甲基转移酶基因trmD(基因ID：BC350_01540)或假定的糖氨基转移酶跨膜蛋白基因wecA(基因ID：BC350_03300)有关。
4菌株适应酸/低温后具有更好的环境适应性，表现在青枯雷尔氏菌适应酸胁迫后其温度适应性增强，同时，酸适应菌株及部分低温实验菌株的药剂耐受性增强
评价了所有实验菌株对其他不良环境的耐受性情况，包括酸适应实验菌株对低温/高温的适应效应、低温实验菌株对贫瘠营养/酸环境的适应效应、所有实验菌株对药剂链霉素的抗性。在相对低温(20℃)条件下生长72h，C49系列菌株(酸适应实验菌株)的生长量是C65系列菌株(对照系列菌株)的1.54倍，整体生长情况显著增加；在相对高温(38℃)条件下生长48h，C49系列菌株整体的生长量显著提升，相较于C65系列菌株增加了1.83倍；说明菌株适应酸环境后能提升适应相对低温/高温环境的能力。低温实验菌株(Tm20菌株)和对照温度实验菌株(Tm30菌株)在营养贫瘠和酸环境下未表现出整体的生长差异，可能与低温实验菌株并未出现可遗传的适应性变异有关；培养时在培养基上变褐的菌株Tm20-2和Tm20-5在营养贫瘠或酸环境下的生长情况均显著低于其他低温实验菌株及原始菌株，说明这种表型改变会影响菌株的环境适应性。另外，通过96孔板法测定药剂链霉素对菌株的MIC值来评价所有实验菌株(包括酸实验菌株C49、C65系列、温度实验菌株Tm20和Tm30系列)对链霉素的抗性敏感性情况。比较链霉素对实验菌株的MIC值可知，酸适应实验菌株(C49系列)的MIC均增加为5.0mg/L，其对照实验菌株C65系列整体的MIC均值为3.5mg/L，原始菌株CQPS-1的MIC值为2.5mg/L。C49系列菌株整体MIC值显著提升，比原始菌株高了2倍，比对照实验菌株整体高了1.43倍。在低温实验菌株(Tm20系列)中，2株菌株(Tm20-3和Tm20-4)的MIC增加为5mg/L。Tm20系列菌株整体的MIC均值为3.5mg/L，其对照实验菌株Tm30系列整体的MIC均值为1.9mg/L。与原始菌株相比，Tm20系列菌株整体MIC值提高了1.43倍；与对照实验菌株整体相比，提升了1.84倍。说明青枯雷尔氏菌在适应酸/低温环境后能提升自身的药剂耐受性。
综上所述，本学位论文以青枯雷尔氏菌为研究对象，分别分析了采自单一寄主的野生型菌株自然群体的遗传进化关系和受单一非生物因子(pH和温度)影响的实验菌株表型变化及适应机制。首先，明确了野生型菌株的序列变种多样性、遗传进化关系；其次，获得了实验室条件下适应特定酸环境和低温环境的实验菌株，发现青枯雷尔氏菌能迅速适应不良环境，并明确了各实验菌株的表型变化及其可能的分子机制，通过基因敲除的方法验证了其中两个基因的功能；最后，通过评价各实验菌株对其他胁迫的耐受性，明确了适应不良环境胁迫后的菌株具有更好的环境适应性。该研究结果为充分理解青枯雷尔氏菌的遗传进化关系方面以及菌株适应长期酸化环境或冷凉环境的机制和进化方向奠定了理论基础，对今后指导酸化区域及冷凉区域更好防控青枯病具有重要意义。
基于此背景，本学位研究论文首先在全国14个种植区选取代表野生型菌株分析了菌株种下遗传多样性及进化情况，并以实验进化(experimental evolution)结合基因组重测序的方法具体分析了青枯雷尔氏菌菌株在实验室条件下适应酸环境和低温环境的过程及可能存在的分子机制，此外，还评估了适应实验菌株的环境适合效应。从自然种群到实验种群，详细阐明了青枯雷尔氏菌菌株的多样性和适应具体非生物因子的分子机制及相关影响。本学位论文的主要研究结果如下：
1明确了全国烟草青枯雷尔氏菌菌株的遗传多样性及系统进化关系，全国烟草青枯病菌具有7个类群，并且发现菌株序列变种的流行、分布与海拔等因子有关
选取了从全国各地区烟草植株上分离的代表菌株107株，采用演化型分类框架中的序列变种分析方法对其进行分类，以分析单一寄主上青枯雷尔氏菌的遗传多样性。基于egl系统发育树可知，全国烟草青枯雷尔氏菌具有序列变种多样性，所有供试菌株可被聚类到8个组群中，分别为序列变种13、14、15、17、34、44、54、55，其中，序列变种55为新归类的组。序列变种的流行与海拔因子具有一定关系，具体来讲，序列变种15和34主要流行于低海拔范围内；序列变种54流行于较高海拔区域。对海拔、温度、土壤pH存在显著差异的西南部生态区和东部生态区的序列变种分布进行统计，结果表明，受不同海拔、温度、土壤pH影响的区域之间序列变种存在显著差异。
对107株代表供试菌株的基因组数据进行分析。基于所有基因组的SNP构建了系统进化树并进行了STRUCTURE分析，结果表明全国烟草青枯病菌可能具有7个类群，大部分同一序列变种的样品在基因组进化树中能聚类在同一分支中，而部分菌株存在杂合情况。同一植烟生态区的菌株分布在不同的遗传结构群中，说明全国菌株在生态区之间存在交叉传播。对菌株中的所有编码基因簇进行阳性选择分析，共计算到628个受到正选择的基因，而根据注释信息和受选择位点情况可知，T3Es、运动性相关基因等致病因子基因受到强烈正选择，说明菌株在适应过程中致病相关基因进化更快。
2通过长期胁迫，获得了适应酸环境/低温环境的青枯雷尔氏菌实验进化菌株，明确了各实验菌株的表型变化情况
分别设置酸和低温两个非生物因子的实验环境对原始菌株CQPS-1进行实验进化，经过长期继代培养后获得单一因子胁迫后的酸适应实验菌株及低温实验菌株。在酸环境(pH4.9的基础培养基)中连续培养1500代后，酸适应实验菌株在酸环境中的适应性显著提升，其生长速率较对照实验菌株增加了1.67倍。在温度胁迫试验中，长期继代培养400d后，Tm20系列实验菌株在20℃震荡培养的条件下整体生长量相较于原始菌株CQPS-1增加1.83倍，相较于对照Tm30系列菌株增加1.26倍，Tm20系列低温实验菌株适应相对低温环境的能力较原始菌株显著增强，与其对照系列菌株相比，虽有增强趋势，但未达到显著水平。
同时，对所有实验菌株表型特性进行了评价，包括所有实验菌株的菌落形态、培养表型、运动性，以及部分菌株的碳源代谢情况。在培养表型及菌落形态方面，长期连续培养后，所有实验菌株均由中心粉红色、白边较宽、流动性强的典型强致病力菌株菌落形态转变为菌落较小、暗红色、白边较窄、流动性差的无致病力菌落形态，此外，有2株低温响应实验菌株(Tm20-2和Tm20-5菌株)在固体平板上出现褐色物质。对所有实验菌株的运动性进行了评价，酸适应实验菌株的运动性显著增强；相较于原始菌株CQPS-1，酸适应实验菌株的运动性晕圈显著增加了1.68倍，而其余所有实验菌株(包括C65系列、Tm20系列、Tm30系列)的运动性均显著降低，分别降低了0.50倍、0.42倍、0.51倍。选取相对低温长期连续培养的3株代表实验菌株(Tm20-2、Tm20-4和Tm20-5)评价了其碳源代谢情况，由AWCD值比较结果可知，低温实验菌株的碳源代谢能力较原始菌株显著提升，其对29种碳源物质的利用率增强。
3基于全基因组重测序的方法明确了酸适应菌株和温度响应菌株的适应性分子机制及相关基因的功能
对不同pH环境中培养的酸实验菌株(5株酸环境的C49菌株和5株对照pH环境的C65菌株)、温度实验菌株(5株低温响应的Tm20系列实验菌株，5株正常温度的对照Tm30系列实验菌株)进行基因组重测序，酸实验菌株共获得23.96Gbp的CleanData，温度实验菌株共获得23.80Gbp的CleanData。
比较分析了C49系列菌株和C65系列菌株之间的变异差异，维恩图结果表明，两个系列的实验菌株中共有的变异基因有127个，而C49系列特有的变异基因有10个，C65系列的特有变异基因有7个。从各菌株基因变异位点情况来看，phcA(基因ID为BC350_10400)、pehR(基因ID为BC350_10115)、spp(基因ID为BC350_11470)可能与菌株适应酸环境及运动性改变有关。采用基因敲除的方法对其中两个基因(spp和pehR基因)分别进行功能验证，明确了信号肽蛋白基因(spp)对菌株菌落形态、正常生长过程、运动性以及对菌株适应酸环境无影响，但在对烟草云烟87的致病力方面具有一定影响；而pehR基因对菌株菌落形态及生长情况的影响较小或几乎无影响，但缺失pehR后菌株运动性下降，且对烟草云烟87的致病力显著降低。结合文献报道，在菌株适应酸环境并发生运动性改变的过程中，主要是phcA和pehR基因在起重要作用。
对Tm20系列和Tm30系列菌株的变异差异基因进行分析，发现两个系列菌株中共有的变异基因有83个，Tm20系列特有的变异基因由8个，Tm30系列特有的基因有5个。但是变异位点比较结果表明，在Tm20系列的5株实验菌株或Tm30系列的5株实验菌株中并未出现共同一致的突变位点，说明在相对低温培养过程中的变异仅为随机变异，目前并未出现明显与适应低温相关的变异基因。此外，还分析了2株Tm20菌株在培养过程中产生褐色这一表型改变的分子机制，由变异位点比较结果推测，该表型变化与tRNA(鸟嘌呤-N1)-甲基转移酶基因trmD(基因ID：BC350_01540)或假定的糖氨基转移酶跨膜蛋白基因wecA(基因ID：BC350_03300)有关。
4菌株适应酸/低温后具有更好的环境适应性，表现在青枯雷尔氏菌适应酸胁迫后其温度适应性增强，同时，酸适应菌株及部分低温实验菌株的药剂耐受性增强
评价了所有实验菌株对其他不良环境的耐受性情况，包括酸适应实验菌株对低温/高温的适应效应、低温实验菌株对贫瘠营养/酸环境的适应效应、所有实验菌株对药剂链霉素的抗性。在相对低温(20℃)条件下生长72h，C49系列菌株(酸适应实验菌株)的生长量是C65系列菌株(对照系列菌株)的1.54倍，整体生长情况显著增加；在相对高温(38℃)条件下生长48h，C49系列菌株整体的生长量显著提升，相较于C65系列菌株增加了1.83倍；说明菌株适应酸环境后能提升适应相对低温/高温环境的能力。低温实验菌株(Tm20菌株)和对照温度实验菌株(Tm30菌株)在营养贫瘠和酸环境下未表现出整体的生长差异，可能与低温实验菌株并未出现可遗传的适应性变异有关；培养时在培养基上变褐的菌株Tm20-2和Tm20-5在营养贫瘠或酸环境下的生长情况均显著低于其他低温实验菌株及原始菌株，说明这种表型改变会影响菌株的环境适应性。另外，通过96孔板法测定药剂链霉素对菌株的MIC值来评价所有实验菌株(包括酸实验菌株C49、C65系列、温度实验菌株Tm20和Tm30系列)对链霉素的抗性敏感性情况。比较链霉素对实验菌株的MIC值可知，酸适应实验菌株(C49系列)的MIC均增加为5.0mg/L，其对照实验菌株C65系列整体的MIC均值为3.5mg/L，原始菌株CQPS-1的MIC值为2.5mg/L。C49系列菌株整体MIC值显著提升，比原始菌株高了2倍，比对照实验菌株整体高了1.43倍。在低温实验菌株(Tm20系列)中，2株菌株(Tm20-3和Tm20-4)的MIC增加为5mg/L。Tm20系列菌株整体的MIC均值为3.5mg/L，其对照实验菌株Tm30系列整体的MIC均值为1.9mg/L。与原始菌株相比，Tm20系列菌株整体MIC值提高了1.43倍；与对照实验菌株整体相比，提升了1.84倍。说明青枯雷尔氏菌在适应酸/低温环境后能提升自身的药剂耐受性。
综上所述，本学位论文以青枯雷尔氏菌为研究对象，分别分析了采自单一寄主的野生型菌株自然群体的遗传进化关系和受单一非生物因子(pH和温度)影响的实验菌株表型变化及适应机制。首先，明确了野生型菌株的序列变种多样性、遗传进化关系；其次，获得了实验室条件下适应特定酸环境和低温环境的实验菌株，发现青枯雷尔氏菌能迅速适应不良环境，并明确了各实验菌株的表型变化及其可能的分子机制，通过基因敲除的方法验证了其中两个基因的功能；最后，通过评价各实验菌株对其他胁迫的耐受性，明确了适应不良环境胁迫后的菌株具有更好的环境适应性。该研究结果为充分理解青枯雷尔氏菌的遗传进化关系方面以及菌株适应长期酸化环境或冷凉环境的机制和进化方向奠定了理论基础，对今后指导酸化区域及冷凉区域更好防控青枯病具有重要意义。