研究目的:胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)是2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)等代谢性疾病的重要病理生理学基础,有氧运动因为能改善机体能量代而被广泛应用于临床肥胖和T2DM的干预、治疗。然而,目前关于有氧运动改善机体能量代谢稳态及IR的确切机制仍不完全清楚。组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDAC)在调控细胞内多种基因的转录平衡中起重要作用。前期研究结果表明,II型HDAC中的HDAC 4/5能显著影响糖脂代谢过程从而调控机体骨骼肌能量代谢,且有氧运动能显著降低胰岛素抵抗小鼠模型中的HDAC 4/5表达。Scriptaid作为一种HDAC抑制剂,研究发现它具有模拟运动改善糖、脂代谢表型的效应,这可能与其抑制HDAC及调节细胞内蛋白的乙酰化修饰有关,但Scriptaid具体能影响哪些蛋白的乙酰化则不甚清楚。与磷酸化、甲基化修饰等相比,对乙酰化的研究一直停滞不前。随着高通量组学技术的发展,开展大规模乙酰化修饰研究现今已无技术障碍。最近10年的研究结果表明,乙酰化修饰在机体代谢调控中有重要作用,它能调控大量代谢酶的活性。越来越多的证据表明,乙酰化普遍修饰代谢酶,并能调节代谢酶的活性从而调控机体代能量谢通路。综上所述,本课题探讨HDAC抑制剂—Scriptaid在有氧运动改善骨骼肌能量代谢中影响糖、脂代谢关键酶乙酰化修饰的作用,以期揭示乙酰化修饰改善机体能量代谢的机制,从而为预防、治疗IR和T2DM等代谢性疾病提供新的靶点。研究方法:(1)动物模型:5周龄C57BL/6雄性小鼠27只,适应性喂养一周后随机分为安静对照组(NC)、运动组(NE)及Scriptaid给药组(S)。运动干预及给药干预结束后,进行有氧能力测试、肌力测试及体成分分析,随后处死取材。(2)运动方案:运动组小鼠干预6周,运动形式为75%VO2max强度的有氧跑台运动,坡度为0,60分/次,1次/天,5次/周。(3)给药方案:Scriptaid给药组小鼠干预6周,腹腔内注射Scriptaid药剂(溶解于含5%DMSO中的生理盐水),剂量1mg/kg体重,1次/天,5次/周。(4)有氧运动能力测试:随机从安静对照组、Scriptaid给药组中选取3只小鼠放在坡度为0的跑台上进行12m/min的持续运动,记录小鼠力竭至脱水状态再也不能运动的时间。(5)肌力测试:将小鼠放置于YLS-13A大小鼠肌力测试仪的测试平台上,待小鼠四肢抓住测试平台上的固定杆后,向后拉小鼠尾巴从而带动测试平台后移,记录肌力读数,重复4次。(6)体成分检测:运动干预结束后使用“Impedi Vet实验动物组成测定分析仪”测定小鼠的体脂含量、去脂体重、体质指数等指标,随后统计分析。(7)OGTT测试:待测小鼠在前日晚7点断食,自由饮水,次日晨8点取尾静脉血测空腹血糖;用20%葡萄糖生理盐水灌胃,剂量1ml/kg体重,分别记录灌胃后15分钟、30分钟、60分钟、120分钟时间点的血糖值,统计分析。(8)蛋白乙酰化修饰组学测定:蛋白抽提、胰酶酶解、TMT标记、HPLC分馏、亲和富集、LC-MS/MS分析、数据库检索。(9)计算机分子对接模拟:使用Auto Dock v4.2.6软件对目标蛋白及其底物小分子进行分子对接模拟,记录并分析对接结果。研究结果:(1)6周有氧运动及Scriptaid给药均能增强小鼠有氧运动耐力、骨骼肌肌力及柠檬酸合酶活性;6周有氧运动能显著降低小鼠的体重、体脂含量、体质指数并增加小鼠的摄食效率,但Scriptaid对小鼠体重、体脂含量、体质指数无影响。(2)6周有氧运动显著降低小鼠血清总胆固醇、甘油三酯、胰岛素和游离脂肪酸含量,且OGTT曲线在15、30、60 min时间点上显著低于安静对照组,OGTT曲线下面积显著降低,运动显著改善小鼠葡萄糖耐量;Scriptaid给药不影响血清胆固醇、甘油三酯,却显著降低血清胰岛素和游离脂肪酸含量,且OGTT曲线在15、30、60 min时间点上显著低于安静对照组,OGTT曲线下面积显著降低,Scriptaid给药显著改善小鼠葡萄糖耐量。(3)运动及Scriptaid给药均引起小鼠骨骼肌中大量蛋白质乙酰化修饰差异变化;运动显著改变中糖代谢关键酶Pfkm、Pkm、Pgk1、Pdha1、Idh1和Ogdh的乙酰化修饰,同时显著改变脂代谢关键酶Acadm、Hadha、Hadh及Acaa2的乙酰化修饰;Scriptaid给药显著改变糖代谢关键酶Pfkm、Pkm、Pgk1、Pdha1、Idh1和Ogdh的乙酰化修饰,同时显著改变脂代谢关键酶Acadm、Hadha、Hadh和Acaa2的乙酰化修饰。(4)计算机分子对接模拟实验结果:Pfkm,144K乙酰化改变了其与底物fructose 6-phosphate的结合;Pgk1,139K乙酰化改变了其与底物1,3-diphosphoglycerate的结合,275K不影响其和底物1,3-diphosphoglycerate的结合;Pdha1,147K乙酰化影响其与底物pyruvate的结合;Pkm,206K乙酰化后其与底物ADP结合改变,与底物phosphoenolpyruvate结合没变化;Idh1,81K乙酰化后与底物NADP~+的结合改变;Ogdh,564K乙酰化后其与底物2-oxoglutarate的结合发生改变,389K乙酰化后不影响其与底物2-oxoglutarate的结合;Acadm,179K乙酰化后其与底物hexanoyl Co A的结合改变;Hadha,728K乙酰化后其与底物2-trans-hexenoyl Co A的结合改变;Hadh,81K乙酰化后其与底物3S-hydroxyhexanoyl Co A结合改变;Acaa2,137K乙酰化后其与底物3-oxohexanoyl Co A结合减弱。研究结论:(1)长期有氧运动及Scriptaid给药均能显著增强有氧运动能力并改善骨骼肌葡萄糖耐量,缓解胰岛素抵抗;(2)长期有氧运动及Scriptaid均显著增强骨骼肌肌小节titin蛋白的乙酰化并能影响titin互作蛋白的乙酰化修饰;(3)长期有氧运动及Scriptaid给药均能显著影响骨骼肌糖、脂代谢通路中一些关键酶的乙酰化修饰水平,通过乙酰化修饰而改变其酶活性,从而影响该酶所催化的代谢过程并改善机体糖、脂代谢平衡。