癌症死亡率与发病率逐年增高,已成为世界范围内的一大健康问题。多西他赛(docetaxel,DTX)是紫杉烷类抗癌药,其作用机制是抑制微管蛋白解聚,从而阻断肿瘤细胞增殖。多西他赛抗癌谱较广,可以用来治疗肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌,治疗效果是紫杉醇的2-4倍。但是其水溶性较差,临床注射液应用吐温80增溶,易引起毒副反应；其分布无特异性,易引起全身毒性。此外,由于紫杉烷类药物的大量使用,导致癌症细胞对紫杉烷类药物产生了多药耐药(multi-drug resistance,MDR)性,这成为DTX使用中的另一大问题。癌症细胞产生耐药性的主要原因是细胞膜转运蛋白p-glycoprotein(p-gp)的过量表达。由于高分子科学的快速发展,应用聚合物高分子作为药物载体包载疏水性药物以增加疏水药物溶解性和治疗效果的研究成为热点。两亲性嵌段聚合物可以在水中聚集为胶束；胶束具有亲-疏水核壳结构,内核疏水而外壳亲水,其疏水内核可以包载疏水性药物。聚合物胶束可以通过物理性包埋和化学结合两种方式包载药物。化学结合载药是将药物和聚合物嵌段通过化学键化学结合形成聚合物-药物结合物(polymer-drug conjugate),药物成为聚合物的一部分,参与胶束的组装。此方法可以增加胶束的载药量和稳定性；还可利用环境敏感的化学键共价连接药物和聚合物,起到在肿瘤部位集中释放药物,提高药物疗效的作用,这也是此类药物传递系统的一大创新点。肿瘤组织内具有较低的pH值,特殊酶和较强的还原性环境,基于此特点,可以采用pH敏感、酶敏感和氧化还原敏感的化学键连接药物,使聚合物具有环境敏感性质。本课题成功合成了具有氧化还原敏感的聚合物-药物结合物,使其在水中自组装,并进一步用于包载其他药物。选择两亲性聚合物甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯乙交酯(mPEG-PLGA,PP)作为大分子骨架,通过氧化还原敏感的二硫键连接DTX,合成敏感的nPEG-PLGA-SS-DTX (PP-SS-DTX)结合物。利用此结合物进一步包载多西他赛或维拉帕米(verapamil, VRP),实现载药体系功能多样化。本课题研究包括以下几个方面：1、PP-SS-DTX结合物的合成和表征：选择含有二硫键的二硫代二丙酸(即DTDP)作为连接分子,通过三步化学反应成功合成了PP-SS-DTX结合物,并通过熔点测定、核磁共振氢谱(1H-NMR);和傅立叶变换红外色谱(FT-IR)验证其结构。此外,通过芘探针法测定其临界聚集浓度(critical aggregation concentration, CAC),发现PP-SS-DTX结合物的CAC值很小,为10.20 μmol/L。2、氧化还原敏感型双模式载多西他赛PP-SS-DTX/DTX胶束系统的评价：通过透析法制备双模式载多西他赛PP-SS-DTX/DTX胶束,双模式是指同一体系中通过化学结合和物理包埋两种模式包载DTX。通过TEM和DLS测定胶束的形态和粒径,所制备的PP-SS-DTX/DTX胶束呈球形,粒径为112.3 nm;PP-SS-DTX/DTX胶束具有较高的载药量,为(14.65±0.71)%。通过溶血试验初步判断PP-SS-DTX/DTX胶束具有一定生物相容性。为验证PP-SS-DTX/DTX胶束释药是否具有氧化还原敏感性,在释放介质中加入还原型物质DTT。释放实验结果表明,与DTX原料药溶液相比,PP-SS-DTX/DTX胶束具有药物缓释、氧化还原敏感性释药和程序性释药的特点。选择乳腺癌MCF-7细胞系和黑色素瘤B16F10细胞系进行体外细胞毒性实验与细胞摄取实验。在两种细胞系中,PP-SS-DTX/DTX胶束的毒性作用均明显强于DTX溶液。由于DTX不能发荧光,利用香豆素-6(coumarin-6, C-6)模拟疏水药物DTX,制备了PP-SS-DTX/C-6胶束,通过荧光倒置显微镜技术和流式细胞术定性、定量的研究细胞对PP-SS-DTX/C-6胶束的摄取。结果表明,MCF-7和B16F10两种细胞对PP-SS-DTX/C-6胶束的摄取效率高于C-6溶液。细胞对胶束制剂的高摄取效率,保证了药物浓集于病变细胞,是提高抗肿瘤效果的重要原因。3、PP-SS-DTX/VRP双模式双载药胶束系统的抗肿瘤多药耐药的评价：采用探头超声法制备PP-SS-DTX/VRP胶束,双模式是指分别通过化学结合和物理包埋方式载药,双载药是指一个胶束体系同时包载两种药物——多西他赛和维拉帕米。维拉帕米是有效的p-gp的拮抗剂,可与p-gp结合并使其失活,逆转癌症细胞的多药耐药。在制备胶束过程中,考察探头超声的超声时间对维拉帕米的包封率与载药量的影响,发现探头超声的时间越短,维拉帕米的载药量和包封率越高。通过TEM和DLS测定胶束的形态和粒径,PP-SS-DTX胶束和PP-SS-DTX/VRP胶束均呈球形,粒径分别为(79.3±1.2)nm和(78.3±4.6)nm。PP-SS-DTX/VRP胶束中DTX载药量为(8.94±0.72)%,维拉帕米的载药量为(5.66±1.60)%,包封率为(53.49±10.96)%。为验证胶束的体外释放是否具有敏感性,在释放介质中加入DTT,实验发现DTX和VRP的释放均具有氧化还原敏感性。为研究胶束的抗肿瘤多药耐药的作用,选择乳腺癌MCF-7细胞和耐药的乳腺癌MCF-7/ADR细胞,进行DTX溶液、PP-SS-DTX胶束和PP-SS-DTX/VRP胶束的细胞毒性实验、细胞摄取实验和细胞凋亡实验。细胞毒性实验表明,PP-SS-DTX胶束和PP-SS-DTX/VRP胶束对两种细胞系的细胞毒性作用均好于DTX溶液；此外,PP-SS-DTX/VRP胶束对MCF-7/ADR细胞的细胞毒性作用强于PP-SS-DTX胶束。由于DTX和VRP不能发荧光,因此选择p-gp底物罗丹明123(rhodamine 123,RH 123)作为荧光分子对胶束进行标记研究细胞摄取情况和p-gp抑制效果。结果表明,MCF-7对PP-SS-DTX胶束和PP-SS-DTX/VRP胶束的细胞摄取效率相似,且均大于RH 123溶液；MCF-7/ADR细胞对RH 123几乎无摄取,对PP-SS-DTX/VRP胶束的摄取大于对PP-SS-DTX胶束的摄取。细胞凋亡实验表明,PP-SS-DTX胶束和PP-SS-DTX/VRP胶束培养的细胞凋亡数目多于DTX溶液组。以上实验结果表明,PP-SS-DTX包载VRP后,可以抑制p-gp的作用,增强耐药细胞对胶束的摄取,加快细胞凋亡的进程,从而提高多西他赛的抗肿瘤效应。4、PP-SS-DTX胶束体内药动学研究：实验动物选择Wistar大鼠,通过尾静脉注射给药,利用HPLC法检测大鼠血浆中DTX的含量。以DTX原料药溶液作对照,观察PP-SS-DTX胶束的体内药动学过程,得到血药浓度-时间曲线,并通过DSA 2.0软件对血药浓度-时间曲线拟合,得PP-SS-DTX胶束房室模型和药动学参数。将DTX制备成PP-SS-DTX胶束后,血药浓度-时间曲线变平缓；通过对曲线拟合,发现DTX溶液和PP-SS-DTX胶束均符合二室模型。将DTX制备成PP-SS-DTX胶束后,体内清除率降低,消除半衰期和体内滞留时间延长,有利于药物缓释并保证药物疗效。综上所述,本研究首次合成了具有氧化还原敏感的聚合物-药物结合物PP-SS-DTX,此结合物可以自组装为胶束,包载DTX或VRP,提高DTX的溶解度和抗肿瘤效果,并能够逆转DTX的MDR。本课题研究具有重要的意义,为提高疏水性药物溶解度、提高药物疗效、解决肿瘤细胞多药耐药的研究提供一定的理论基础。