论文部分内容阅读
抗生素相继诞生,是现代医学的奇迹。但随着抗生素的不合理应用,伴随了耐药菌的不断出现。因此,在抗菌药物研发工作中,新思路、新技术的应用是新型抗生素筛选的关键所在。本论文应用反义RNA基因沉默技术,选取大肠杆菌45个核糖体蛋白基因为靶点,构建了 45个反义RNA菌株,并将部分所构建菌株应用于对临床上常用抗生素的敏感性分析实验与筛选新型抗菌药物实验两部分内容中。1、选取大肠杆菌45个核糖体蛋白基因为靶标,应用pHN678反义RNA表达载体,构建重组质粒,转化Escherichia coli DH5α,成功构建了 24个大肠杆菌50S大亚基核糖体蛋白、21个30S小亚基核糖体蛋白的反义RNA菌株。2、采用生长表型检测法及分子生物学方法对所构建的核糖体蛋白反义RNA菌株进行基因沉默效率分析。通过生长表型分析,靶向34个生长必需基因、9个生长非必需基因的反义RNA菌株均出现生长表型受抑制现象;2个生长非必需基因的反义RNA菌株未出现生长受抑制表型。通过分子生物学方法,验证反义RNA片段可引起目标靶基因mRNA转录水平下降。3、对靶向非必需基因E.coli DH5α/rpsF反义RNA菌株进行转录水平分析,发现反义RNA菌株E.coli DH5α/rpsF生长受抑制的原因是由于此反义RNA引起了同一操纵子下另一必需基因rpsR的转录水平降低。4、应用29株反义RNA菌株,验证其对20个常用抗生素的药物敏感性分析图谱,分析发现反义RNA低表达菌株对抗生素更敏感,且不同靶标的反义RNA菌株与抗生素存在协同或者拮抗作用。5、将7株靶向rpsA、rpsL、rpsR、rplC、rplS、rplT、rpmA必需基因反义 RNA 菌株构建药物筛选模型。并将其应用于1600份放线菌发酵样品的活性筛选实验。初筛阳性率分别为 1.44%、1.69%、1.25%、1.19%、1.50%、1.25%、1.56%;复筛阳性率分别为 1.19%、1.50%、1.00%、0.88%、1.38%、1.06%、1.44%。