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目的 探讨Wnt信号通路对成体小鼠脊髓神经干细胞增殖分化的影响。 方法 ①成体小鼠脊髓神经干细胞的分离培养及多向分化能力的鉴定：采用无血清培养基(DMEM／F12+EGF+B27)及单细胞克隆技术，从成年小鼠脊髓中分离培养获得具备单细胞克隆能力的细胞，经免疫荧光染色鉴定神经干细胞特异性抗原—Nestin的表达。经诱导分化7天后，免疫荧光染色鉴定神经元标志物—微管相关蛋白-2（MAP-2）与星型胶质细胞标志物—胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。 ②pSecTag2／Hygro B-Wnt3a真核表达载体的构建及鉴定：Trizol试剂提取孕13.5天小鼠胚脑总RNA，利用RT-PCR方法扩增小鼠胚脑Wnt-3a包含CDS的cDNA，回收纯化PCR产物，构建pMD18-T Vector-Wnt3a克隆质粒，转化入感受态大肠杆菌JM109，经PCR初筛，阳性克隆MIuⅠ和HindⅢ双酶切并送测序。以测序鉴定正确的克隆质粒为模板进行PCR扩增，回收纯化PCR产物，回收产物与空白质粒pSecTag2／Hygro B同时行XhoⅠ和HindⅢ双酶切，回收酶切产物，T4 DNA连接酶作用后，转化入感受态大肠杆菌JM109，LB琼脂平板培养过夜。经PCR初筛，阳性克隆行XhoⅠ和HindⅢ双酶切并送上海生工生物技术公司测序，测序结果使用Blast软件与GeneBank数据库进行同源性分析。 ③Wnt信号通路对成体小鼠脊髓神经干细胞增殖分化的影响：取纯化的重组质粒pSecTag2／Hygro B-Wnt-3a，在脂质体试剂LipofectamineTM 2000的作用下转染成体小鼠脊髓神经干细胞，Western blot鉴定重组Wnt-3a蛋白在成体小鼠脊髓神经干细胞中获得表达。Western blot鉴定β-catenin表达的改变，以证实Wnt信号通路被激活。对转染后携带Wnt-3a基因成体小鼠脊髓神经干细胞诱导分化后，免疫