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肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli,EHEC) O157:H7是一种重要的动物源性致病菌,易引起婴幼儿及老人腹泻、出血性结肠炎(HC)、血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)及溶血性尿毒综合征(HUS)等严重并发症,部分HUS病例可致死亡。该菌长期驻留于牛、羊、猪、鸡等家畜家禽的肠道中,牛是其主要的贮存宿主,造成幼龄动物腹泻,并污染畜禽产品及水源和农作物等,给农牧业带来巨大的损失,也对人们的健康构成巨大威胁。自首次于美国发现因该菌引起的食物中毒以来,疫情不断扩散蔓延,在多个国家相继引起暴发流行,我国于2000年也发生暴发流行,危害程度可能是迄今为止最严重的一次。目前还没有理想的疫苗能够防治该菌引起的感染。研制能够减少宿主动物排菌的疫苗,以减少传染源对人类健康的威胁是该领域的主要研究方向。1. O157:H7pCold Ⅰ-tir-tccp重组质粒的构建和融合蛋白的表达采用PCR方法获得目的基因tir-tccp,构建pCold Ⅰ-tir-tccp重组质粒。转化E.coli BL21(DE3)后IPTG诱导,超声破菌后SDS-PAGE检测目的蛋白主要存在于上清,表明Tir-Tccp蛋白以可溶形式表达。Western blot鉴定目的蛋白具有良好的反应原性。2.肠出血性大肠杆菌O157:H7Intimin和Tir-Tccp蛋白对小鼠免疫保护性研究研究不同浓度的O157:H7Intimin和Tir-Tccp蛋白对接受1×1010CFU O157:H7小鼠的免疫保护作用。将Intimin和Tir-Tccp蛋白和佐剂充分乳化后,通过背部和腹部皮肤皮下多点注射的方式免疫小鼠,对照组注射等量的PBS。共免疫两次,间隔14d,末次免疫后的14d攻毒O157:H71×1010CFU/只。在每次免疫后的14d通过断尾采血,用间接ELISA检测血清抗体。攻毒后,观察小鼠精神状态,记录死亡数并检测排菌。ELISA结果表明,Tir-Tccp蛋白诱导小鼠产生IgG抗体水平明显升高,而Intimin诱导产生的IgG抗体升高不明显。攻毒后,两个免疫组小鼠均死亡1只,存活14只,存活率为93.3%；对照组小鼠死亡4只,存活6只,存活率为60%。免疫组在攻毒后6d,粪便中检测不到0157：H7；而对照组在攻毒后13d仍有较高的排菌量。本实验表明紧密素和Tir-Tccp蛋白对小鼠起到了有效的免疫保护性作用,能够减少0157：H7在小鼠体内的定植。3.肠出血性大肠杆菌0157：H7感染牛羊试验以1×1010CFU/只EHEC O157:H7的剂量通过灌胃方式攻毒动物,检测牛、羊的粪便排菌量和排菌时间。攻毒前,所有动物饮用5g/L的链霉素溶液3d,目的是增强0157：H7在肠道内的定植。攻毒前所有动物禁水、禁食12h,攻毒后12h恢复饮水、饮食。攻毒后给予所有动物0.5g/L的链霉素溶液。攻毒后的24h开始检测粪便的排菌量。结果显示,牛最长排菌时间为17d,最高排菌量达5×105CFU;羊最长排菌时间达13d,最高排菌量为1×10SCFU。本实验对EHEC O157:H7主要宿主的排菌时间和粪便排菌量做了初步研究,为探索EHEC O157:H7感染宿主机制和用于疫苗效力评价及动物模型的建立奠定了基础。