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猪萨佩罗病毒（Porcine sapelovirus,PSV）是近年来新发现的猪肠道病的病原体,属于小RNA病毒科,萨佩罗病毒属。感染PSV的动物可以表现出多种临床症状（如腹泻、肺炎、脑脊髓灰质炎、生殖障碍等）,同时也可以表现隐形感染。上世纪60年代在猪的肠道中首次分离获得了 PSV。随后,多个国家报道猪群中存在PSV的感染。然而,目前国内外对于PSV流行病学的研究较多,其致病性、分子生物学等研究信息匮乏。因此,本研究制备了能够高度特异性识别PSV VP1蛋白的单克隆抗体,并利用Western blot鉴定分析其抗原表位。还分析了 PSV诱导细胞凋亡的分子机制,探索了 PSV感染细胞中诱导凋亡的病毒蛋白。这些工作的顺利开展为PSV的后续研究奠定了科学理论基础。具体内容如下:1、猪萨佩罗病毒VP1蛋白单抗的制备单克隆抗体技术是其他分子生物学研究的重要工具。VP1蛋白是PSV的主要免疫原性蛋白。故本研究针对VP1蛋白进行该蛋白的原核表达,以期获得VP1单抗。以PSV-HuN2株基因序列为模板,扩增得到VP1截短序列,酶切连接到大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1上,大量表达并切胶纯化重组蛋白。将分离纯化所得到的特异性VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠。随后又分别依次经过PEG1500细胞融合、IFA筛选阳性杂交瘤细胞株、亚克隆体的筛选与克隆纯化等关键过程,获得一株针对PSV VP1蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株33-2A。将该杂交瘤细胞扩大培养并注射入小鼠腹腔,得到腹水单抗。后续实验结果表明,该单抗能够特异性识别PSV VP1蛋白,适用于IFA、Western Blot、IP等实验。随后,对33-2A单抗识别的B细胞抗原表位进行鉴定。将免疫用的VP1基因片段插入真核表达载体pEGFP-C3中进行表达,采用Western blot实验鉴定单抗33-2A的抗原表位。结果表明,单抗33-2A识别PSVVP1蛋白的第40～46位氨基酸40PALTAAE46,通过与NCBI上大多数PSV毒株序列进行比对,发现该表位序列在大多数PSV毒株中高度保守。VP1蛋白单克隆抗体的成功制备及其B细胞抗原表位特异性的鉴定,为PSV病毒的分离及鉴定、新型疫苗的开发等奠定了坚实的基础。2、猪萨佩罗病毒诱导细胞凋亡分析本研究通过对PSV感染细胞进行CPE、TUNEL、AnnexinV-FITC/PI流式、Caspase蛋白凋亡检测,发现PSV能够在ST和HEK293A细胞上激活线粒体介导的内源性凋亡途径,活化下游凋亡执行者Caspase-3,切割凋亡底物PARP,造成DNA断裂,细胞瓦解。加入广谱凋亡抑制剂Z-VAD-FMK或Caspase-9专用抑制剂（Z-LEHD-FMK）后,可以明显地抑制PSV诱导的细胞凋亡,并且抑制了 PSV的复制,表明PSV感染促进凋亡的发生;加入Caspsae-8专用抑制剂（Z-IETD-FMK）后,发现其对PSV诱导的凋亡不具有抑制作用。抑制剂的引入再次反向验证PSV通过线粒体介导的内源性途径诱导凋亡。进一步地探究发现,随着PSV感染量的加大,宿主细胞线粒体上存在的细胞凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比率迅速上升,细胞整体都处于一个促细胞凋亡的状态。同时激活的Caspase-9会导致线粒体膜通透性发生改变,使Cytc、endoG等蛋白质从线粒体释放到细胞质中。最后通过JC-1染料直接定位被PSV感染的宿主细胞线粒体,发现PSV感染ST细胞只会改变其线粒体外膜通透性,不会降低其线粒体膜电位。这些初步研究阐明了 PSV可以通过线粒体介导的内源性激活途径直接诱导细胞发生凋亡。3、猪萨佩罗病毒2A蛋白诱导细胞凋亡分析目前,PSV基因组中编码的各个蛋白功能尚不清晰,到底是PSV的哪一个蛋白或者哪一些蛋白具有诱导细胞凋亡的能力呢?因此,我们构建了一组PSV蛋白真核质粒,筛选PSV中诱导凋亡的病毒蛋白。将PSV编码的各个基因分别插入pCAGGS-3×Flag真核载体中进行表达,在PSV各个蛋白都正常表达的条件下,通过Western blot检测凋亡底物RARP的裂解情况。结果发现与其他小RNA病毒蛋白不同,PSV的3C蛋白酶不具有诱导细胞凋亡的能力。但是有趣地发现,PSV的2A蛋白能够明显的诱导细胞发生凋亡,激活与PSV感染相同的线粒体凋亡路径,从而激活下游凋亡执行者Caspase-3,切割底物PARP。接着我们对2A蛋白中可能诱导细胞凋亡的关键氨基酸位点进行点突变,发现第164位上的半胱氨酸突变后,其诱导细胞凋亡功能完全丧失,这提示2A蛋白的第164位半胱氨酸是2A蛋白诱导细胞凋亡的关键氨基酸位点。PSV诱导细胞凋亡的病毒蛋白筛选证实了 2A蛋白在诱导细胞凋亡中的重要作用,为进一步地阐明PSV的致病机制以及病毒与宿主之间的相互作用提供了参考价值。