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近些年水产养殖产业发展迅速，饲料原料日益紧张，水产动物饲料供需矛盾逐年增加。目前，急需开发具有高营养价值新型饲料原料，来缓解水产饲料供需矛盾。具有高营养价值且价格低廉木本植物是水产动物饲料理想新型饲料原料，而木本植物中抗营养因子严重限制了木本饲料推广与应用。肠道微生物在机体营养代谢过程中具有极为重要的价值。目前，有关木本饲料对水产动物肠道微生物多样性影响研究较少，尤其，有关卵形鲳鲹肠道微生物多样性研究，尚未见报道。因此，本试验首次基于illumina技术对卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）肠道内容物微生物多样性进行测序，分析卵形鲳鲹肠道微生物多样性，并将其与尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）肠道内容物微生物多样性对比研究。同时，本研究系统地分析新型木本饲料对卵形鲳鲹和尼罗罗非鱼肠道微生物多样性影响，筛选降解辣木饲料中单宁特异菌株，确定辣木饲料发酵工艺，为新型木本饲料地推广与应用提供理论指导。具体研究内容和结果如下：
1. 卵形鲳鲹和尼罗罗非鱼肠道微生物多样性研究
基于illumina二代测序技术，对随机选取健康卵形鲳鲹和尼罗罗非鱼肠道内容物进行微生物多样性分析。结果表明，卵形鲳鲹和尼罗罗非鱼肠道微生物主要由梭杆菌门（Fusobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）组成。其中，变形菌门和厚壁菌门在卵形鲳鲹肠道微生物中丰度显著高于其在尼罗罗非鱼肠道微生物中丰度（P＜0.05）。梭杆菌门在卵形鲳鲹肠道微生物中丰度显著低于其在尼罗罗非鱼肠道微生物中丰度（P＜0.05）。乳酸菌属（Lactobacillus）在卵形鲳鲹肠道微生物中丰度高于其在尼罗罗非鱼肠道微生物中丰度（P＜0.05）。鲸孢杆菌属（Cetobacterium）在卵形鲳鲹肠道微生物中丰度显著低于其在尼罗罗非鱼肠道微生物中丰度（P＜0.05）。此外，卵形鲳鲹和尼罗罗非鱼肠道微生物代谢通路主要包括氨基酸代谢、碳代谢、能量代谢、核酸代谢等。其中，精氨酸和脯氨酸代谢通路在卵形鲳鲹肠道微生物丰度显著高于其在尼罗罗非鱼肠道微生物丰度（P＜0.05）。碳代谢、糖酵解和糖异生、丙酮酸代谢通路在卵形鲳鲹肠道微生物丰度显著低于其在尼罗罗非鱼肠道微生物丰度（P＜0.05）。
2. 木本饲料对卵形鲳鲹肠道微生物多样性影响研究
分别添加30%辣木叶、构树叶、桑叶和黄梁木叶木本饲料投喂初始体重为34.4±0.5 g的卵形鲳鲹56 d。结果显示，饲料中分别添加30%辣木叶、黄梁木叶、构树叶和桑叶卵形鲳鲹肠道前肠和中肠淀粉酶活性显著升高（P＜0.05）。同时，利用基于illumina二代测序技术对饲喂木本饲料的卵形鲳鲹肠道内容物进行测序，结果显示，在门水平上，变形菌门在构树叶组中丰度显著高于其在黄梁木叶组丰度（P＜0.05）。厚壁菌门在黄梁木叶组丰度显著高于其在桑叶组和构树叶组丰度（P＜0.05）。在属水平上，乳酸菌属在黄梁木叶组丰度显著高于其在构树叶组、辣木叶组及桑叶组丰度（P＜0.05）。主成份和热图表明，饲喂木本饲料的卵形鲳鲹肠道微生物组成较为相似。PICRUSt分析表明，ABC transporters丰度在构树叶组中丰度显著高于其在对照组和桑叶组中丰度（P＜0.05）。甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路在桑叶组丰度显著高于其在对照组、构树叶组、黄梁木叶组和辣木叶组丰度（P＜0.05）。
3. 木本饲料对尼罗罗非鱼肠道微生物多样性影响研究
分别添加30%的辣木叶、构树叶、桑叶和黄梁木叶的木本饲料投喂初始体重为100.0±10.0 g的尼罗罗非鱼45 d。利用基于illumina二代测序技术，对饲喂木本饲料的尼罗罗非鱼肠道内容物进行测序，结果显示，饲喂木本饲料的尼罗罗非鱼肠道微生物中梭菌杆门、变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门丰度差异不显著 （P＞0.05）。饲喂木本饲料的尼罗罗非鱼肠道微生物中鲸孢杆菌属丰度差异不显著（P＞0.05）。主成份和热图表明，饲喂木本饲料的尼罗罗非鱼肠道微生物组成呈现一定相似性。PICRUSt分析表明，饲喂木本饲料尼罗罗非鱼肠道微生物的主要代谢通路为氨基酸合成和碳代谢，且肠道微生物代谢通路丰度无显著差异（P＞0.05）。
4. 饲喂木本饲料的两种鱼肠道微生物丰度差异分析
投喂辣木叶饲料、构树叶饲料的卵形鲳鲹肠道微生物中拟杆菌门丰度显著低于投喂辣木叶饲料、构树叶饲料的尼罗罗非鱼肠道微生物中拟杆菌门丰度（P＜0.05）。而投喂辣木叶饲料、构树叶饲料的尼罗罗非鱼肠道微生物中梭杆菌门丰度显著高于投喂辣木叶饲料、构树叶饲料的卵形鲳鲹肠道微生物中梭杆菌门的丰度（P＜0.05）。投喂辣木叶饲料、构树叶饲料、黄梁木叶饲料和桑叶饲料的尼罗罗非鱼肠道微生物中鲸孢杆菌属丰度显著高于投喂辣木叶饲料、构树叶饲料、黄梁木叶饲料和桑叶饲料的卵形鲳鲹肠道微生物中鲸孢杆菌属丰度（P＜0.05）。
5. 降解辣木饲料单宁微生物筛选与鉴定
本试验成功地分别从投喂辣木饲料的尼罗罗非鱼肠道内容物和辣木树根部土壤中筛选到一株降解单宁的微生物。经过分子生物学与显微镜形态观察，两株降解单宁的微生物分别为黑曲霉（Aspergillus niger）和聚多曲霉（Aspergillus sydowii）。经过辣木叶饲料固体发酵试验，结果表明，所筛选的两株微生物均能显著降低辣木叶饲料中单宁含量（P＜0.05），且聚多曲霉降解辣木叶饲料中单宁效果优于黑曲霉降解辣木叶饲料中单宁效果。
6. 辣木饲料发酵工艺条件优化
本试验利用L9（3×3）正交设计方法，对发酵温度、发酵时间、接种量三因素进行条件优化，发酵菌株为聚多曲霉。结果显示，聚多曲霉发酵辣木叶饲料的最优组合是A1B3C3（发酵温度30℃，接种量5%，发酵时间9 d），辣木叶饲料发酵后单宁含量显著低于未发酵辣木叶饲料中单宁含量（P＜0.05）。辣木叶发酵后粗蛋白含量显著高于未发酵辣木叶混合物的粗蛋白含量（P＜0.05）。其中，试验组A1B3C3辣木叶中单宁的降解率为67.1%，粗蛋白提高率为17.6%，发酵辣木叶中天冬氨酸、丝氨酸、缬氨酸和苏氨酸含量均显著高于未发酵辣木叶中天冬氨酸、丝氨酸、缬氨酸和苏氨酸含量（P＜0.05）。
本试验利用L9（3×3）正交设计方法，对发酵温度、发酵时间、接种量、混合菌株接种比例四因素进行条件优化，发酵菌株为聚多曲霉和枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）。结果显示，聚多曲霉和枯草芽孢杆菌混合菌株发酵辣木叶最优组合是试验组A1B3C2D3（发酵温度30℃，接种量5%，发酵时间9 d，聚多曲霉与枯草芽孢杆菌混合比例2∶1）。辣木叶饲料发酵后单宁含量显著低于未发酵辣木叶饲料中单宁含量（P＜0.05）。辣木叶饲料发酵后粗蛋白含量显著高于未发酵辣木叶饲料中粗蛋白含量（P＜0.05）。试验组A1B3C2D3中单宁降解率为46.2%，粗蛋白提高率为24.1%，辣木叶发酵后缬氨酸含量显著高于未发酵辣木叶饲料中缬氨酸含量（P＜0.05）。考虑辣木叶饲料发酵后单宁、粗蛋白和氨基酸含量等因素，本试验推荐发酵辣木叶最优方案为，利用聚多曲霉单菌株，发酵温度30℃，接种量5%，发酵时间9 d。
1. 卵形鲳鲹和尼罗罗非鱼肠道微生物多样性研究
基于illumina二代测序技术，对随机选取健康卵形鲳鲹和尼罗罗非鱼肠道内容物进行微生物多样性分析。结果表明，卵形鲳鲹和尼罗罗非鱼肠道微生物主要由梭杆菌门（Fusobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）组成。其中，变形菌门和厚壁菌门在卵形鲳鲹肠道微生物中丰度显著高于其在尼罗罗非鱼肠道微生物中丰度（P＜0.05）。梭杆菌门在卵形鲳鲹肠道微生物中丰度显著低于其在尼罗罗非鱼肠道微生物中丰度（P＜0.05）。乳酸菌属（Lactobacillus）在卵形鲳鲹肠道微生物中丰度高于其在尼罗罗非鱼肠道微生物中丰度（P＜0.05）。鲸孢杆菌属（Cetobacterium）在卵形鲳鲹肠道微生物中丰度显著低于其在尼罗罗非鱼肠道微生物中丰度（P＜0.05）。此外，卵形鲳鲹和尼罗罗非鱼肠道微生物代谢通路主要包括氨基酸代谢、碳代谢、能量代谢、核酸代谢等。其中，精氨酸和脯氨酸代谢通路在卵形鲳鲹肠道微生物丰度显著高于其在尼罗罗非鱼肠道微生物丰度（P＜0.05）。碳代谢、糖酵解和糖异生、丙酮酸代谢通路在卵形鲳鲹肠道微生物丰度显著低于其在尼罗罗非鱼肠道微生物丰度（P＜0.05）。
2. 木本饲料对卵形鲳鲹肠道微生物多样性影响研究
分别添加30%辣木叶、构树叶、桑叶和黄梁木叶木本饲料投喂初始体重为34.4±0.5 g的卵形鲳鲹56 d。结果显示，饲料中分别添加30%辣木叶、黄梁木叶、构树叶和桑叶卵形鲳鲹肠道前肠和中肠淀粉酶活性显著升高（P＜0.05）。同时，利用基于illumina二代测序技术对饲喂木本饲料的卵形鲳鲹肠道内容物进行测序，结果显示，在门水平上，变形菌门在构树叶组中丰度显著高于其在黄梁木叶组丰度（P＜0.05）。厚壁菌门在黄梁木叶组丰度显著高于其在桑叶组和构树叶组丰度（P＜0.05）。在属水平上，乳酸菌属在黄梁木叶组丰度显著高于其在构树叶组、辣木叶组及桑叶组丰度（P＜0.05）。主成份和热图表明，饲喂木本饲料的卵形鲳鲹肠道微生物组成较为相似。PICRUSt分析表明，ABC transporters丰度在构树叶组中丰度显著高于其在对照组和桑叶组中丰度（P＜0.05）。甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路在桑叶组丰度显著高于其在对照组、构树叶组、黄梁木叶组和辣木叶组丰度（P＜0.05）。
3. 木本饲料对尼罗罗非鱼肠道微生物多样性影响研究
分别添加30%的辣木叶、构树叶、桑叶和黄梁木叶的木本饲料投喂初始体重为100.0±10.0 g的尼罗罗非鱼45 d。利用基于illumina二代测序技术，对饲喂木本饲料的尼罗罗非鱼肠道内容物进行测序，结果显示，饲喂木本饲料的尼罗罗非鱼肠道微生物中梭菌杆门、变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门丰度差异不显著 （P＞0.05）。饲喂木本饲料的尼罗罗非鱼肠道微生物中鲸孢杆菌属丰度差异不显著（P＞0.05）。主成份和热图表明，饲喂木本饲料的尼罗罗非鱼肠道微生物组成呈现一定相似性。PICRUSt分析表明，饲喂木本饲料尼罗罗非鱼肠道微生物的主要代谢通路为氨基酸合成和碳代谢，且肠道微生物代谢通路丰度无显著差异（P＞0.05）。
4. 饲喂木本饲料的两种鱼肠道微生物丰度差异分析
投喂辣木叶饲料、构树叶饲料的卵形鲳鲹肠道微生物中拟杆菌门丰度显著低于投喂辣木叶饲料、构树叶饲料的尼罗罗非鱼肠道微生物中拟杆菌门丰度（P＜0.05）。而投喂辣木叶饲料、构树叶饲料的尼罗罗非鱼肠道微生物中梭杆菌门丰度显著高于投喂辣木叶饲料、构树叶饲料的卵形鲳鲹肠道微生物中梭杆菌门的丰度（P＜0.05）。投喂辣木叶饲料、构树叶饲料、黄梁木叶饲料和桑叶饲料的尼罗罗非鱼肠道微生物中鲸孢杆菌属丰度显著高于投喂辣木叶饲料、构树叶饲料、黄梁木叶饲料和桑叶饲料的卵形鲳鲹肠道微生物中鲸孢杆菌属丰度（P＜0.05）。
5. 降解辣木饲料单宁微生物筛选与鉴定
本试验成功地分别从投喂辣木饲料的尼罗罗非鱼肠道内容物和辣木树根部土壤中筛选到一株降解单宁的微生物。经过分子生物学与显微镜形态观察，两株降解单宁的微生物分别为黑曲霉（Aspergillus niger）和聚多曲霉（Aspergillus sydowii）。经过辣木叶饲料固体发酵试验，结果表明，所筛选的两株微生物均能显著降低辣木叶饲料中单宁含量（P＜0.05），且聚多曲霉降解辣木叶饲料中单宁效果优于黑曲霉降解辣木叶饲料中单宁效果。
6. 辣木饲料发酵工艺条件优化
本试验利用L9（3×3）正交设计方法，对发酵温度、发酵时间、接种量三因素进行条件优化，发酵菌株为聚多曲霉。结果显示，聚多曲霉发酵辣木叶饲料的最优组合是A1B3C3（发酵温度30℃，接种量5%，发酵时间9 d），辣木叶饲料发酵后单宁含量显著低于未发酵辣木叶饲料中单宁含量（P＜0.05）。辣木叶发酵后粗蛋白含量显著高于未发酵辣木叶混合物的粗蛋白含量（P＜0.05）。其中，试验组A1B3C3辣木叶中单宁的降解率为67.1%，粗蛋白提高率为17.6%，发酵辣木叶中天冬氨酸、丝氨酸、缬氨酸和苏氨酸含量均显著高于未发酵辣木叶中天冬氨酸、丝氨酸、缬氨酸和苏氨酸含量（P＜0.05）。
本试验利用L9（3×3）正交设计方法，对发酵温度、发酵时间、接种量、混合菌株接种比例四因素进行条件优化，发酵菌株为聚多曲霉和枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）。结果显示，聚多曲霉和枯草芽孢杆菌混合菌株发酵辣木叶最优组合是试验组A1B3C2D3（发酵温度30℃，接种量5%，发酵时间9 d，聚多曲霉与枯草芽孢杆菌混合比例2∶1）。辣木叶饲料发酵后单宁含量显著低于未发酵辣木叶饲料中单宁含量（P＜0.05）。辣木叶饲料发酵后粗蛋白含量显著高于未发酵辣木叶饲料中粗蛋白含量（P＜0.05）。试验组A1B3C2D3中单宁降解率为46.2%，粗蛋白提高率为24.1%，辣木叶发酵后缬氨酸含量显著高于未发酵辣木叶饲料中缬氨酸含量（P＜0.05）。考虑辣木叶饲料发酵后单宁、粗蛋白和氨基酸含量等因素，本试验推荐发酵辣木叶最优方案为，利用聚多曲霉单菌株，发酵温度30℃，接种量5%，发酵时间9 d。