【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproduction and respiratory syndrome,PRRS)最早于80年代后期在美国爆发,1991年,荷兰最先分离猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproduction
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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproduction and respiratory syndrome,PRRS)最早于80年代后期在美国爆发,1991年,荷兰最先分离猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproduction and respiratory syndrome virus,PRRSV)Lelystad株(LV)。直至今日,依然没有有效的措施防治此病,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。先前研究中,本研究室从感染PRRSV的猪肺中分离和鉴定一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)毒株 GXNN1396,并将该毒株在MARC-145细胞中传代适应,获得该毒株的细胞适应株GXNN1396-P96。本论文将GXNN1396-P96分为五段扩增后,在已有的PRRSV感染性克隆pAJX25HB的基础上,将pAJX25HB的分段对应替换成GXNN1396-P96的基因片段,最后获得了 GXNN1396-P96的全长cDNA克隆,命名为pGXAM。为了将构建的克隆与亲本病毒区分,通过突变PCR,在pGXAM中插入一个酶切位点Mlu I。将全长cDNA克隆质粒转染至BHK-21细胞,48小时后在MARC-145细胞上进行传代,3天后能够观察到明显的细胞病变。对拯救的病毒进行IFA(Indirect immunofluorescence assay)试验后,病毒感染的细胞中有特异的PRRSV N蛋白表达。RT-PCR和测序分析也表明传代的拯救病毒含有遗传标记位点Mlu Ⅰ,以上结果均说明病毒拯救成功。多步生长曲线结果显示拯救病毒rGXAM和亲本病毒GXNN1396-P96有着相似的生长曲线、病毒滴度以及空斑大小,说明拯救的病毒与亲本病毒有着相似的的生物学特性。致弱毒株的感染性克隆的成功构建为研究高致病性PRRSV的致病机理以及研发新型的基因工程疫苗奠定基础。
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