金铁锁毛状根工厂化培养的关键技术

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金铁锁(Psammosilene tunicoides)是我国南方民间独有的药用植物,国家二级保护植物,具有去镇痛、预风湿、祛瘀的功效,多用于临床治疗风湿疼痛、跌打损伤、外伤出血、胃痛等病症,是“云南白药”的主要组成成分之一。由于金铁锁自然生长区域有限,乱采乱伐现象严重,使得金铁锁的自然生存条件尤为恶劣,因此优化金铁锁的培养条件,实现金铁锁的工厂化生产具有重要的意义。金铁锁根部为其有效成分的主要植体部分。不同的营养物质和生长条件对野生金铁锁诱导产生毛状根的生长速度和最终生物量具有重要影响。因此本实验以探索不同培养方式,优化培养条件,模拟工业化生产,最终测量其有效成分来探索最佳保种和生产条件,为大规模工业化生产提供有力的理论依据。本研究对苗药金铁锁根部进行处理并与发根农杆菌侵染得到金铁锁毛状根,以此为实验材料。主要研究内容有:(1)研究不同基础培养基对金铁锁毛状根固体活化培养的影响;(2)利用响应面分析优化金铁锁毛状根液体扩大培养;(3)确定优化后金铁锁毛状根生长与有效成分积累关系;(4)优化金铁锁毛状根生物反应器液体培养条件;(5)金铁锁毛状根生物反应器液体培养产物、糖耗以及最终灰分质量分数分析;(6)金铁锁毛状根生物反应器液体培养皂苷HPLC检测。(7)金铁锁毛状根生物反应器液体培养黄酮物质抗氧化性研究。主要结论如下:1.固体培养基种类为B5培养基,蔗糖浓度为30g/L、初始接种量为60g/L,生长周期为32d,此时生物量可达到最大12.79g/L(DW),生长速度为0.39g/d,总皂苷含量为96.30mg/L。金铁锁毛状根组织形态中单位长度根生长点数为2.73±0.59,单位长度侧根生长数2.33±0.52,最大生长级数可为3级。2.响应面法优化液体培养的最优条件为:起始p H为5.86、蔗糖浓度32.06g/L、IBA浓度为1.25mg/L。模拟条件培养金铁锁毛状根培养可得可得最终生物量为11.89g/L(DW),增长率为9.72%,总皂苷含量96.37mg/L。3.液体扩大培养优化后金铁锁毛状根生长期线特征:0-20d为延滞期,20-24d为对数生长期,最大生长速率达到0.18g(L/d),24-30d为稳定期,30d之后进入衰亡期。当金铁锁毛状根液体培养到30d时,最终生物量为12.03g/L(DW),增长率为9.66%,总皂苷含量为96.19mg/L均达到峰值。4.优化后生物反应器液体培养金铁锁毛状根最优条件:起始p H5.86、起始加强为2.20k Pa、通气量为100m L/min,B5为基础培养基,加入32.06g/L的蔗糖和1.25mg/L的IBA。5.优化后生物反应器液体培养金铁锁毛状根最终得到总皂苷含量为98.36mg/L,生物量为14.18/L(DW),最终糖消耗比例为94.73%。金铁锁毛状根灰分质量为0.17±0.04g/g。而野生金铁锁根、茎、叶灰分质量分别为0.19±0.06g/g、1.52±0.02g/g、1.11±0.03g/g。6.野生金铁锁根组织和生物反应器培养的金铁锁毛状根皂苷总浓度分别为0.076mg/m L和0.098mg/m L,可以得出优化后生物反应器培养的金铁锁毛状根产出总皂苷较野生金铁锁毛状根相比高出22.44%。7.金铁锁毛状根总黄酮具有一定的还原能力,还原能力与金铁锁毛状根总黄酮浓度表现出正相关的关系。总黄酮清除DPPH自由基的清除率与金铁锁毛状根总黄酮浓度正相关,其中金铁锁毛状根总黄酮的IC50为0.040mg/m L。总黄酮清除-OH自由基的清除率与金铁锁毛状根总黄酮浓度正相关,其中金铁锁毛状根总黄酮的IC50为0.042mg/m L。
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