论文部分内容阅读
背景:肺动脉高压是指一组以肺动脉压力升高和肺循环阻力增大的一种血流动力学和病理生理状态,严重的可以导致右心衰竭,是一种预后差,死亡率高的慢性肺循环疾病,它可以是一种独立的疾病,也可以是某种疾病相关的并发症。野百合碱（monocrotaline,MCT）诱导的肺动脉高压大鼠是经典的肺动脉高压模型之一,其作用机制可能与MCT经肝代谢的毒性产物引起内皮细胞损伤,释放多种炎症反应介质,引起肺动脉收缩,肺血管重构有关。目前肺动脉高压的发病机制主要集中在遗传基因学、缺氧、内皮损伤、炎症等几个方面,其中炎症反应机制备受研究者关注。炎性介质可引起血管收缩,促进血管重构。肺动脉高压时炎性细胞因子（如IL–1β和IL–6）水平升高,阻断炎性因子的生成可有效抑制MCT诱导的肺动脉高压的发生,这提示炎症反应是导致肺动脉高压发病的重要病理机制之一。近年来的多项研究表明肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC）胞浆中游离Ca2+浓度(intracellula free calcium concentration,[Ca2+]i)的增加、炎症反应、PASMC的增殖在分子细胞水平上对肺动脉高压的形成起到至关重要的作用。瞬时感受器电位通道（transient receptor potential channels,TRP通道）是一类包含50多种家庭成员的非选择性阳离子通道超家族,瞬时感受器电位香草素受体亚家族IV型（transient receptor potential vanilloid4,TRPV4）是TRPV受体亚家族成员之一,TRPV4受体作为一种主要对Ca2+具有选择通透性的阳离子通道,广泛分布在哺乳动物体内多种组织、细胞中。TRPV4受体在血管内皮细胞及平滑肌细胞上均有高表达,存在于内皮细胞上的TRPV4可以通过其介导的Ca2+内流调节内皮源性舒张因子的释放,存在于血管平滑肌细胞上的TRPV4受体可以通过调节胞浆中的Ca2+浓度参与调控平滑肌细胞的舒缩活动。因此,TRPV4受体对血管舒缩活动起重要调节作用。既往研究发现激活伤害感受器等细胞上的TRPV4受体可导致炎症反应;TRPV4受体活化后可以促进血管内皮细胞增殖和重新定位,参与血管重构。然而,TRPV4受体介导肺动脉高压炎症反应的具体机制目前还尚无报道。本实验通过建立MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型,观察TRPV4受体在肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌上的表达,进一步探索TPRV4受体介导的炎症反应在肺动脉高压的发生发展中的作用及机制。目的:研究TRPV4受体在MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型上肺动脉高压炎症反应中的作用及机制。材料与方法:第一部分MCT诱导肺动脉高压大鼠模型的建立及TRPV4受体在肺动脉血管平滑肌组织炎症反应中的作用一、实验方法1.实验动物分组:取雄性SD大鼠40只,随机分为四组,分别为对照组（注射等剂量0.9%生理盐水10只）,肺动脉高压模型MCT组:注射MCT以60 mg/kg的剂量一次性给予腹腔注射造模10只),HC组:（腹腔注射TRPV4受体阻断剂HC-067047,HC-067047剂量为10mg/kg,每天一次,连续注射28天）;MCT+HC组（腹腔注射HC-067047,30分钟后注射MCT,此后HC-067047以10mg/kg,每天一次腹腔注射,至第28天造模终止）。2.MCT致肺动脉高压大鼠模型的建立:用2%野百合碱（MCT）以60 mg/kg的剂量一次性给予腹腔注射,28天后右心导管法检测肺高压模型监测指标为:1)平均肺动脉压（mean pulmonary arterial pressure,m PAP）;2)肺动脉收缩压（pulmonary arterial systolic pressure,PASP）;3)右心室肥厚指数（right ventricular右心室重量（RV）hypertrophy index,RVHI）=×100%;肺组织左心室重量（LV）（10）室间隔（S）病理切片及HE染色:对照组、MCT组大鼠肺组织送病理切片及HE染色观察肺组织及肺血管的病理变化、炎性细胞浸润情况,测量肺动脉壁中膜厚度及管腔直径,计算肺小动脉中膜厚度百分比（wall thickness,WT%）。3.免疫蛋白印迹（Western blot）:用Western blot检测MCT诱导肺动脉高压大鼠的肺血管平滑肌组织TRPV4受体蛋白水平的改变。4.免疫组化:用免疫组化技术检测MCT组大鼠肺组织中肺血管重构组织学及肺动脉平滑肌上炎性反应的变化。二、结果:1.MCT诱导肺高压大鼠模型组的mPAP、PASP、RVHI这三项指均较对照组比较明显升高,提示肺动脉高压造模成功。2.MCT组大鼠肺组织病理HE染色显示肺动脉管壁明显增厚,平滑肌层增生增厚明显,管腔狭窄,肺小动脉中膜厚度百分比（WT%）明显增高。3.MCT组大鼠肺组织及肺动脉周围有明显的中性粒细胞及单核细胞浸润,MCT大鼠肺动脉平滑肌上炎性标志物CD68及MPO表达明显升高。4.MCT组大鼠肺动脉平滑肌组织中TRPV4蛋白水平升高明显。5.HC组大鼠肺组织HE染色形态学结构、CD68及MPO的表达与对照组无显著差异,MCT+HC组大鼠肺组织HE染色的病理改变、中性粒细胞及单核细胞浸润较MCT组显著减轻,CD68、MPO的表达量与MCT组相比降低。三、结论:TRPV4受体在MCT诱导肺动脉高压大鼠的肺动脉平滑肌上表达增加;阻断TRPV4能减轻MCT诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌的炎症反应。第二部分TRPV4受体介导MCT诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌炎性反应的机制一、实验方法:1.实验动物分组:取雄性SD大鼠20只,随机分为照组（注射等剂量0.9%生理盐水10只）和肺动脉高压模型组（注射MCT造模10只）。2.大鼠肺动脉平滑肌标本留取及肺动脉平滑肌细胞的培养:新生SD大鼠,麻醉处死后取肺组织分离出肺动脉平滑肌,37℃下分别经消化酶I（30min）和消化酶II（60min）后终止消化。将细胞中加入20%FBS DMEM并接种于60mm培养皿中,在37℃含5%CO2的培养箱中培养,每3-4天传代一次,可传5-6代,取前3代细胞备用。3.药物处理及分组:对照组（正常培养的PAMSC）;GSK1016790A组（在培养基中加入TRPV4受体激动剂GSK1016790A（50 n M）孵育细胞24小时）;Ac组（用caspase-1选择性阻断剂Ac-YVAD-cmk（10μM）孵育细胞24小时）;GSK+Ac组（用50 n M GSK1016790A和10μM Ac-YVAD-cmk孵育细胞24小时）。4.免疫蛋白印迹（Western blot）:用Western blot方法测定MCT组大鼠肺动脉平滑肌组织及各实验组PASMC中NLRP3炎性小体组成蛋白NLRP3、ASC、caspase-1及炎性细胞因子IL–1β、IL–6、TNF–α的蛋白水平的变化。二、结果:1.MCT组大鼠肺动脉平滑肌组织中NLRP3炎性小体NLRP3、ASC、caspase-1的蛋白水平明显升高,炎性细胞因子IL–1β、IL–6、TNF–α的蛋白水平显著升高。2.用TRPV4受体激动剂GSK1016790A孵育PASMC24小时后,PASMC中NLRP3、ASC、caspase-1的蛋白水平明显升高,炎性细胞因子IL–1β、IL–6、TNF–α的蛋白水平显著升高。3.caspase-1抑制剂Ac-YVAD-cmk对正常大鼠PASMC中IL–1β、IL–6、TNF–α的蛋白水平无显著影响,但可以显著阻断GSK1016790A升高IL–1β、IL–6、TNF–α蛋白水平的作用。三、结论激活TRPV4受体可能通过促进肺动脉平滑肌组织中NLRP3炎性小体活化,增加炎性细胞因子的释放,介导炎症反应。阻断TRPV4受体可能通过抑制其介导的炎性细胞因子的释放来减轻MCT诱导的肺动脉平滑肌的炎性反应。