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草酸（C2H2O4）又称乙二酸,是最简单的二元酸,普遍存在于动植物组织中,在体内以不可溶性及可溶性形式存在。研究表明,植物草酸目前主要由以下3条途径合成,乙醛酸/乙醇酸途径、抗坏血酸途径和草酰乙酸途径。最初,草酸被认为是植物中一种不能再进一步分解的代谢终产物。随着人们对草酸的进一步研究,发现它还可被进一步代谢降解。植物中草酸主要由3条途径进行分解,即乙酰化、氧化和脱羧。早期的研究认为草酸是对植物有害而无益的。然而近年来的研究表明,草酸在植物中具有重要的生理功能:（1）与细胞稳态相关;（2）与植物生物胁迫、非生物胁迫的防御有关;（3）与PCD、气孔的开闭互相关联等。虽然越来越多研究表明草酸在植物中起到重要的生理功能,但目前草酸在中合成部位尚未清楚,因而阻碍了人们对草酸的功能及机理的认知。本实验将草酸氧化酶（oxalate oxidase,OxO3）定向表达于水稻叶绿体、液泡、过氧化物酶体、线粒体中,检测这些不同亚细胞定位的草酸氧化酶是否可引起植物草酸含量的变化,从而推测草酸是否合成或积累于以上某个亚细胞中,获得实验结果如下:（1）OsOxO3定向表达于叶绿体、液泡、过氧化物酶体、线粒体水稻转基因植株的获得过表达于叶绿体的载体分别由玉米泛素化启动子（p Ubi）与花椰菜花叶病毒Ca MV35S增强型启动子（p E35S）启动表达,信号肽序列则使用水稻rbc S叶绿体信号肽（rCTP）添加到过表达载体p Ox的N端,在C端添加GFP蛋白基因,构建载体rCTP-OxO-GFP,瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察目的蛋白能正确定位与表达,去掉GFP片段,构建载体rCTP-OxO,经农杆菌介导法侵染水稻愈伤组织获得后代植株,再经过潮霉素纯合筛选及OxO活性显色检测,最终获得由p Ubi启动表达的纯合株系rCTP-OxO7-1、rCTP-OxO8-1,由35S启动表达的纯合株系rCTP-OxO18-2-1、rCTP-OxO20-3-5。OsOxO3定向表达于液泡、线粒体、过氧化物酶体的载体均由玉米泛素化启动子（p Ubi）启动;液泡信号肽为VTP（Vacuolar signal peptid）,添加到过表达载体p Ox的N端,构建VTP-OxO载体,在C端添加GFP片段。线粒体信号肽为MTP（Mitochondrial signal peptide）,添加到过表达载体p Ox的N端,构建MTP-OxO载体,再在C端添加GFP片段。过氧化物酶体的信号肽PTS（Peroxidase targeting signal）则在蛋白C端添加三个氨基酸丝氨酸（S）、精氨酸（R）、亮氨酸（L）,构建载体,命名为OxO-PTS,再在N端添加GFP。瞬时表达后在激光共聚焦显微镜下观察目的蛋白正确定位与表达,将以上载体载体去掉GFP,经农杆菌介导法侵染水稻愈伤组织获得后代植株,再经过潮霉素纯合筛选及OxO活性显色检测,获得植株VTP-OxO1-6、VTP-OxO3-6、MTP-OxO8-1、MTP-OxO10-5、OxO-PTS4-4、OxO-PTS5-3。经OxO酶活检测,四种不同亚细胞转基因株系中的OxO活性皆明显提高。（2）四种不同亚细胞定位的转基因株系中的草酸含量变化rCTP-OxO7-1、rCTP-OxO8-1、rCTP-OxO18-2-1、rCTP-OxO20-3-5转基因株系中的草酸含量与WT无明显差异,而定向表达于液泡、线粒体、过氧化物酶体的转基因株系在分蘖期、孕穗期、抽穗期、灌浆期草酸含量呈不同程度下降。在木村B营养液培养条件下,与WT相比,VTP-OxO1-6在分蘖期、孕穗期、灌浆期草酸含量下降了22%～39%,其中,灌浆期草酸含量下降最显著,抽穗期与WT无差别;VTP-OxO3-6的分蘖期、灌浆期草酸含量下降了22～42%,分蘖期下降量最显著,孕穗期和抽穗期与WT无差异;MTP-OxO8-1分蘖期、孕穗期、抽穗期、灌浆期草酸含量WT相比,下降了29%～47%,其中分蘖期最显著;MTP-OxO10-5分蘖期与灌浆期草酸含量与WT相比,下降了45%～53%,孕穗期与抽穗与WT无差异;OxO-PTS4-4与OxO-PTS5-3分蘖期、孕穗期、抽穗期、灌浆期草酸含量皆下降,前者4个时期草酸下降量下降了44～60%,其中抽穗期最显著,后者4个时期草酸下降量下降了40～60%,其中抽穗期最显著。土培条件下,与WT相比,VTP-OxO1-6分蘖期、孕穗期、抽穗期草酸含量下降了34%～57%,其中,分蘖期最显著,灌浆期与WT无差异。VTP-OxO3-6分蘖期、孕穗期、抽穗期草酸含量下降了37%～50%,其中,分蘖期最显著,灌浆期与WT无差异;MTP-OxO8-1分蘖期、孕穗期、灌浆期草酸含量与WT相比下降了30%～59%,其中灌浆期最显著,抽穗期与WT无差异;MTP-OxO10-5四个时期草酸含量与WT相比,下降了31%～53%,其中灌浆期最显著;OxO-PTS4-4分蘖期、孕穗期、抽穗期、灌浆期草酸含量与WT相比,下降了WT的41%～71%之间,分蘖期最显著;OxO-PTS5-3分蘖期、孕穗期、抽穗期、灌浆期草酸含量与WT相比,下降了WT的32%～56%之间,分蘖期最显著。（3）不同草酸氧化酶过表达株系的表型观测经表型观测结果表明,相对与WT的株型,纯合植株rCTP-OxO7-1、rCTP-OxO8-1、rCTP-OxO18-2-1、rCTP-OxO20-3-5在株高、叶色等株型无显著差异,VTP-OxO1-6、VTP-OxO3-6与MTP-OxO8-1、MTP-OxO10-5以及OxO-PTS4-4、OxO-PTS5-3株高低于WT,且VTP-OxO1-6、VTP-OxO3-6株高降低最为显著,其余表型性状与WT无明显差异。