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自上世纪90年代以来,定向进化技术作为一种体外优化蛋白质性质的方法,取得了令人瞩目的成就。定向进化技术将基因突变和高通量筛选相结合,在实验室中模拟自然进化中的关键步骤:突变、重组和筛选,加快了分子进化过程,能在短期内获得具有优良性质的突变酶;同时,对突变体性质变化的结构基础和分子机理进行分析,加深了对蛋白质结构-功能关系的理解,因此定向进化技术也成为人类获取蛋白质化学知识的重要途径之一。本文选定两种具有重要研究及应用价值的酶:嗜热酰基肽水解酶及糖基转移酶作为研究对象,运用定向进化对其性质进行优化,并通过对突变体的酶学性质表征、计算机同源建模、分子动力学模拟等技术对突变体性质变化的分子机制进行了深入的探讨。(一)通过对来自嗜热古菌Aeropyrum pernix K1的超嗜热酰基肽水解酶apAPH进行结构分析发现,其活性中心附近的Arg526在POP家族中高度保守,但在与其相关的脂肪酶家族成员中的对应位点均为疏水残基。为了探讨该位点对于酶催化及底物选择性的重要作用,我们运用半理性设计策略构建了526位点的饱和突变库,通过筛选获得了底物选择性发生重大变化的突变体,并且通过酶动力学及计算生物学手段阐明了526位点对于肽酶/酯酶活力转换的重要作用,揭示了蛋白酶及脂肪酶家族的进化相关性;进一步的结构分析显示,Arg526参与到了apAPH催化活性中心附近的离子网络中,与推进器结构域上的Glu88形成了一对保守的、跨结构域的盐桥。为了阐明这个盐桥对于酶催化的影响及其在酶家族中保守的原因,我们针对Glu88和Arg526位点设计了一系列盐桥突变体,通过定点突变、酶动力学和计算生物学等手段,证明了Glu88-Arg526这对跨结构域盐桥对于酶的催化功能及保持酶在高温下的正确折叠具有重要作用。(二)我们以来自于Campylobacter jejuni的β-1,3-糖基转移酶CgtB为模型,建立了针对糖基转移酶的超高通量筛选方法(>108克隆/天),是目前唯一可以对糖基转移酶活力进行高效筛选的方法,为这个重要的酶家族的定向进化提供了强有力的工具。应用此种筛选方法,我们成功地提高了CgtB的催化活力。最优突变体的相对活力比野生型提高了28倍。酶动力学分析表明,进化突变体的Km值均较野生型明显下降,即突变体通过提高酶与底物的结合力,促进了酶催化的进行。