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目的:探究20S蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)在人骨髓间充质干细胞(h BMSCs)衰老进程中的影响,旨在揭示蛋白酶体活性对细胞衰老的影响,为延缓细胞的衰老指出一条可行性策略,以期为干细胞临床治疗研究提供新的思路。方法:分别构建PSMB5与绿荧光蛋白(GFP)融合表达的慢病毒载体感染体外培养晚期的h BMSCs,并依照感染病毒的不同将细胞分为PSMB5实验组和GFP对照组。1.通过Real-time PCR和Western bloting验证PSMB5过表达效率。2.应用荧光分光光度法检测20S蛋白酶体活性。3.利用溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)免疫荧光染色观察增殖情况,通过Western来检测细胞周期相关的蛋白:P21、Cyclin D1、CDK4的表达变化。4.应用SA-β-gal染色法观察h BMSCs衰老情况。5.在培养基中加入不同浓度(0μM、50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM)的H2O2,形成氧化损伤环境加速细胞衰老,探讨氧化环境对细胞损伤、衰老的影响,应用CCK-8法测定氧化应激条件下h BMSCs的细胞活性。结果:1.Real-time PCR结果显示PSMB5-m RNA水平亦较GFP组显著提高5.24±0.22倍(P<0.01),同时20S蛋白酶体其余亚单位PSMB1、PSMB2、PSMB6的m RNA水平变化无统计学意义;Western bloting结果显示PSMB5基因过表达后在实验组中PSMB5蛋白表达水平约为GFP组的2.70±0.19倍(P<0.01)。2.PSMB5组中20S蛋白酶体活性升高,相较GFP组为1.55±0.21倍(P<0.05)。3.在Brd U免疫荧光实验中,PSMB5组的Brd U阳性细胞数为37.91%±1.82%,而GFP组阳性细胞数为28.18%±1.98%(P<0.01)。免疫印迹检测提示PSMB5组中细胞周期相关蛋白表达水平较GFP组明显上调,P21上调1.45±0.05倍(P<0.01)、Cyclin D1上调1.56±0.16倍(P<0.01)、CDK4上调1.23±0.06倍(P<0.05)。4.SA-β-gal染色结果显示PSMB5组中衰老阳性细胞数40%±3.7%较GFP组的55%±3%偏低(P<0.01)。5.CCK-8法检测细胞活性检测结果表明,细胞活性与H2O2浓度之间存有一定的依赖性,h BMSCs的细胞活力会随H2O2的孵育浓度升高而降低(P<0.01);而在相同的H2O2浓度下,PSMB5组中h BMSCs具有较高的细胞活性,其中当H2O2的孵育浓度为300μM时的OD值之比约为2.11±0.23倍(P<0.01),而当浓度为500μM时,两组间没有统计学意义;测定当H2O2的孵育浓度为300μM时20S蛋白酶体活性的结果发现PSMB5组中20S蛋白酶体活性升高,相较GFP组为1.37±0.12倍(P<0.01)。说明在氧化应激的条件下,PSMB5过表达可以保护细胞活力,防止细胞衰老。结论:1.过表达PSMB5可以增强h BMSCs 20S蛋白酶体活性,提高细胞增殖能力,延缓衰老。2.氧化环境中,过表达PSMB5可以保护h BMSCs因氧化应激产生的损伤,使细胞仍保持较高的活性,抑制了细胞衰老进程。提示PMSB5可能是抑制细胞衰老提高细胞活力的重要靶点。