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杜仲具有补肝肾强筋骨的功效,盐炙后杜仲补肝肾作用增强。杜仲中木脂素类是杜仲抗骨质疏松作用的有效成分之一,其中松脂素二葡萄糖苷已被证明具有成骨作用,而松脂素在这方面还没有报道。本实验通过检测杜仲生品水提液及其30%部位、杜仲盐炙品水提液及其30%部位、松脂素二葡萄糖苷和松脂素对MC3T3-E1成骨细胞增殖分化和OPG/RANKl/RANK系统的影响来探讨杜仲盐炙前后及其单体成分的成骨作用和机制。实验方法:本实验以MC3T3-E1成骨细胞为模型,将一定浓度的杜仲生品水提液及其30%部位、杜仲盐炙品水提液及其30%部位、松脂素二葡萄糖苷和松脂素单体化合物分别作用于MC3T3-E1细胞48h和72h,根据不同的实验要求选择合适的浓度和作用时间点,检测细胞活性,ALP活性,OPG和RANKL蛋白分泌和表达情况。本实验采用MTT法检测细胞的活性,微板法检测ALP的活性,ELISA法检测细胞上清OPG蛋白和RANKL蛋白的含量,Western Blot法检测细胞OPG蛋白和RANKL蛋白的表达。实验结果:1.一定浓度的杜仲生品水提液和杜仲盐炙品水提液作用于成骨细胞48h和72h后,细胞活性显著上升,其中生品在中低浓度作用显著,盐品在高中低浓度都能显著促进细胞增殖,且盐炙品优于生品。杜仲生品水提液30%部位作用于细胞48h时,中低浓度能够促进成骨细胞增殖,培养72h时,高浓度杜仲生品水提液也能促进细胞增殖;杜仲盐炙品水提液30%部位作用于成骨细胞48h和72h后,高中低浓度均能够促进成骨细胞增殖。松脂素二葡萄糖苷在48h时对成骨细胞增殖无明显影响,在72h时,高中浓度能够显著促进细胞增殖;松脂素在48h时,仅10-3ug/L和10-2ug/L能够促进细胞增殖,在72h时,仅10-1ug/L能够显著促进成骨细胞增殖。松脂素二葡萄糖苷对细胞增殖的促进作用要强于松脂素。2.一定浓度的杜仲生品水提液作用于成骨细胞48h,高中低浓度均能够显著促进细胞ALP分泌,作用72h时,高浓度和低浓度能够促进ALP的分泌;一定浓度的杜仲盐炙品水提液作用于成骨细胞48h和72h后,高中低浓度均能够促进ALP的分泌,较长时间作用下促ALP分泌作用优于生品。一定浓度的杜仲生品水提液30%部位和杜仲盐炙品水提液30%部位作用于成骨细胞48h、72h,高中低浓度都可以明显促进细胞ALP分泌;低浓度的杜仲生品水提液30%部位对ALP的分泌促进作用弱于杜仲盐炙品水提液30%部位,中高浓度的杜仲生品水提液30%部位对ALP的分泌促进作用强于杜仲盐炙品水提液30%部位。一定浓度松脂素二葡萄糖苷作用于细胞48h,高中低浓度均可促进ALP分泌,作用72h时,高中浓度可以促进ALP分泌。一定浓度松脂素作用于细胞48h和72h,高中低浓度均可促进ALP分泌。在48h时杜仲水提液及其30%部位、杜仲盐炙品水提液及其30%部位、松脂素二葡萄糖苷和松脂素对ALP分泌的促进作用优于72h。3.一定浓度的杜仲生品水提液和杜仲盐炙品水提液作用于成骨细胞48h,高浓度促进细胞OPG分泌,而高中低浓度均显著抑制RANKL的分泌;作用72h时,杜仲盐炙品水提液高中低浓度均能够促进OPG分泌抑制RANKL分泌,杜仲生品水提液在10-4ug/L、10-3ug/L、10-1ug/L和10ug/L促进OPG的分泌,10-4-102ug/L均抑制RANKL的分泌。48h和72h,杜仲生品水提液和杜仲盐炙品水提液均能够上调OPG/RANKL,在72h时,杜仲盐炙品水提液强于生品。一定浓度的杜仲生品水提液30%部位作用于成骨细胞48h,高中低浓度促进细胞OPG分泌,其中10-2ug/L和10-1ug/L作用最显著,而高中低浓度均显著抑制RANKL的分泌;作用72h时,高中低浓度均能抑制RANKL蛋白的分泌。一定浓度的杜仲盐炙品水提液30%部位作用于成骨细胞48h,高中低浓度促进细胞OPG蛋白的分泌而抑制RANKL蛋白的分泌;作用72h时,高中低浓度均能够抑制RANKL蛋白的分泌。48h时,杜仲生品水提液30%部位和杜仲盐炙品水提液30%部位均能够上调OPG/RANKL。72h时,杜仲盐炙品水提液30%部位在10-5ug/L能够上调OPG/RANKL。48h和72h,10-5ug/L、10-3ug/L、10-1ug/L松脂素二葡萄糖苷能够促进OPG的分泌。48h时,松脂素在10-5ug/L、10-3ug/L、10-1ug/L、10ug/L能够促进OPG的分泌,72h时,松脂素在10-1ug/L、10ug/L能够促进OPG的分泌;48h和72h时,松脂素在10-5ug/L和10-3ug/L抑制RANKL分泌。4.1-10-4ug/L杜仲生品水提液通过抑制RANKL蛋白表达而上调OPG/RANKL。102ug/L、1ug/L和10-2ug/L杜仲盐炙品水提液通过促进细胞OPG蛋白表达抑制RANKL蛋白表达而上调OPG/RANKL。10-5ug/L、10-3ug/L、10-1ug/L和10ug/L杜仲生品水提液30%部位通过促进OPG而上调OPG/RANKL。10-5ug/L、10-3ug/L杜仲盐炙品水提液30%部位主要通过抑制RANKL蛋白表达来上调OPG/RANKL。10-5ug/L、10-3ug/L、10-1ug/L和10ug/L松脂素二葡萄糖苷促进OPG和RANKL蛋白表达。10-5ug/L、10-3ug/L、10-1ug/L松脂素主要通过促进OPG蛋白表达抑制RANKL蛋白表达来上调OPG/RANKL。5.一定浓度杜仲生品水提液及其30%部位、杜仲盐炙品水提液及其30%部位、松脂素二葡萄糖苷和松脂素,抑制剂(10-5mol/L),抑制剂与药物的混合物作用于细胞72h,LY和SB抑制剂对MC3T3-E1的细胞活性有显著抑制作用,杜仲生品水提液及其30%部位、杜仲盐炙品水提液及其30%部位、松脂素二葡萄糖苷和松脂素促MC3T3-E1细胞增殖作用受LY、SB、PDTC和PD抑制剂的影响。实验结论:一定浓度的杜仲生品水提液及其30%部位、杜仲盐炙品水提液及其30%部位、松脂素二葡萄糖苷和松脂素能够促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化,促进细胞OPG蛋白、抑制RANKL蛋白的分泌和表达,且盐炙品作用强于生品,松脂素作用强于松脂素二葡萄糖苷。杜仲生品水提液及其30%部位、杜仲盐炙品水提液及其30%部位、松脂素二葡萄糖苷和松脂素促细胞增殖作用与ERK、p38MAPK、NF-κB、AKT通路有关。