论文部分内容阅读
目的：通过组织块法培养人牙龈成纤维细胞(1uman gingival fibroblast, HGFs),观察HGFs体外培养的生物学特性,探讨人类β-防御素3(Human Beta-Defensins3, hBD3)对HGFs增殖情况的影响,通过分析hBD3及与Pg-LPS联合作用对HGFs分泌PGE2和MMP-1的情况,初步探讨此过程中可能涉及到的TLR, MAPK, PI3K, NF-κB各级信号通路。研究hBD3在牙周炎致病机制方面的作用。方法：1.组织块培养法体外培养人牙龈成纤维细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫组织化学方法鉴定细胞来源,3-6代细胞用于实验。2.四甲基偶氮唑盐比色法(methyl thiazolyl terazolium, MTT)动态检测人牙龈成纤维细胞在不同浓度hBD3干预下增殖情况。3.酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)检测不同浓度hBD3不同时间点HGFs上清液中PGE2和MMP-1的含量,以及加入Pg-LPS以及不同信号抑制剂产生PGE2和MMP-1的量。4.特定浓度hBD3,分别与等体积NF-κB信号抑制剂SN-50,50UM; PI3K信号抑制剂LY294002,20UM; JNK信号抑制剂SP600125,20UM; P38信号抑制剂SB203580,20UM; ERK信号抑制剂PD98059,10UM,分析hBD3刺激HGFs分泌PGE2和MMP-1涉及的信号通路。结果：1.采用组织块培养法能够在体外成功培养出HGFs。倒置相差显微镜下观察细胞胞核均染,呈长梭形,并围绕组织块呈放射状排列。抗角蛋白染色阴性,抗波形丝蛋白染色阳性,可见细胞来源于中胚层,结合取材部位证实所培养细胞为HGFs。2.MTT检测结果显示,10ug/ml的hBD3分别与对照组和0.3ug/ml组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)；10ug/ml的hBD3对HGFs的增殖作用最显著。第3天细胞进入对数生长期,第5-6天细胞生长减缓,第7天逐渐进入平台期,细胞生长曲线大致呈S形。3. ELISA法检测显示,1ug/ml hBD3与对照组及10ug/ml hBD3组相比刺激HGFs产生PGE2差异均有统计学意义(P<0.05),且随着时间延长,PGE2的分泌量高于其他组；而对于MMP-1, hBD3浓度为1ug/ml时,与对照组及0.3ug/ml hBD3浓度组相比差异均有统计学意义(P<0.05),且随着时间延长,MMP-1的分泌量高于其他组。4.hBD3组与Pg-LPS组,Pg-LPS+hBD3组比较,在刺激HGFs产生PGE2和MMP-1的过程中Pg-LPS作用最强,hBD3组最弱,且三组之间均有显著性差异。5.hBD3联合多种信号通路(TLR, MAPK, PI3K, NF-κB)抑制剂,刺激HGFs产生PGE2和MMP-1的量均下降,且减少的量与信号抑制剂种类相关。hBD3刺激HGFs产生PGE2的过程可被SP600125,SC-3060特异性阻断；产生MMP-1过程中可被SB203580, PD98059, SC-3060, anti-TLR2抗体特性性阻断。结论：1.组织块培养法可成功培育出HGFs;细胞生长代谢旺盛,分裂较快,满足实验要求,培养过程中无菌操作,避免污染,是确保细胞培养成功的关键。2.一定浓度的hBD3能促进HGFs增殖及其分泌PGE2和MMP-1,实验结果显示1ug/ml为hBD3的最佳效应浓度,最佳显效时间为12h。3.hBD3, Pg-LPS, hBD3+Pg-LPS三者作用HGFs产生PGE2, MMP-1的结果说明：Pg-LPS刺激产生PGE2, MMP-1作用最强,可见Pg-LPS对牙周组织具有较高的毒性,在牙周病的发生发展中起着重要作用；hBD3在致炎方面与Pg-LPS相比作用较弱；hBD3与Pg-LPS联合作用时,hBD3抵消部分Pg-LPS产生PGE2, MMP-1的作用,使得Pg-LPS致炎作用减弱。4.hBD3刺激HGFs产生PGE2是通过MAPK中的JNK通路和NF-κB通路；hBD3刺激HGFs产生MMP-1过程中涉及了TLR2和MAPK中的P38、ERK信号通路以及NF-κB通路。