背景:脑缺血后的再灌注损伤严重威胁着人类的生命健康。氧化应激在脑缺血再灌注损伤的发生发展中发挥着重要作用。机体内源性抗氧化系统能够抵御氧化应激损伤。Nrf2作为内源性抗氧化系统中的关键因子,在脑缺血再灌注时,能够有效对抗此过程中产生的氧化应激损伤。因此,找到能够有效调控Nrf2的关键分子,对于对抗脑缺血再灌注损伤至关重要。GSK-3β这个多功能激酶,在以往的很多研究中都表现出了对Nrf2的调控作用,它参与对Nrf2在细胞核内外的分布的调控,对其功能起负性调控作用。目的:探讨GSK-3β在脑缺血再灌注损伤时对Nrf2的调控作用,通过调控内源性抗氧化系统中的关键分子Nrf2,增强机体内源性抗氧化作用,发挥神经保护功能。方法:(1)实验对象:SD大鼠(240-300g)(2)筛选大鼠脑缺血再灌注损伤后GSK-3β活化时间点:构建大鼠MCAO模型,栓塞1h后,再灌注1h、6h、24h这三个时间点后提取大脑组织蛋白,运用Western Blot法,评价以下四个蛋白的表达量的变化:GSK-3β、GSK-3β(P-tyr216)、β-catenin、Nrf2,选取GSK-3β活化的时间点作为后续实验再灌注时间点。(3)大鼠gsk-3βsirna/活性阻滞。(1):gsk-3β化学合成的sirna片段左侧侧脑室注射sd大鼠,转染48h后,检测gsk-3βsirna在大脑皮层的转染率,通过westernblot法,评价以下蛋白表达量的变化:gsk-3β、gsk-3β(p-tyr216)、nrf2。荧光定量pcr法测定gsk-3βmrna的表达量,以及nrf2mrna的量,筛选最有效的干扰片段。(2):大鼠侧脑室注射gsk-3β活性抑制剂(licl、sb216763)。(4)大鼠gsk-3βsirna/活性阻滞后,不构建mcao模型(1):筛选出的gsk-3βsirna片段左侧侧脑室注射sd大鼠,55h后westernblot检测gsk-3β、gsk-3β(p-tyr216)、总nrf2、核内nrf2表达量的变化;荧光定量pcr检测gsk-3β、nrf2mrna量的变化。(2):大鼠左侧侧脑室注射gsk-3β活性抑制剂(licl、sb216763),通过westernblot法检测以下蛋白表达量的变化:gsk-3β、gsk-3β(p-tyr216)、总nrf2、核内nrf2蛋白量;荧光定量pcr检测gsk-3β、nrf2mrna量的变化。(5)gsk-3βsirna/活性阻滞后,构建大鼠mcao模型。(1):筛选出的gsk-3βsirna片段左侧侧脑室注射sd大鼠,转染48h后,构建mcao模型,运用westernblot法,检测以下四个蛋白表达量的变化:gsk-3β、gsk-3β(p-tyr216)、总nrf2、核内nrf2蛋白量;荧光定量pcr检测gsk-3β、nrf2mrna量的变化;emsa法检测gsk-3β对nrf2/are结合活性的影响;qrt-pcr及westernblot法分别检测gsk-3β对are编码蛋白nqo1、ho-1mrna及蛋白表达的影响。(2):大鼠左侧侧脑室注射gsk-3β活性抑制剂(licl、sb216763),抑制6h后,构建mcao模型,通过westernblot法,检测以下四个蛋白表达量的变化:gsk-3β、gsk-3β(p-tyr216)、总nrf2、核内nrf2蛋白量;荧光定量pcr检测gsk-3β、nrf2mrna量的变化;emsa法检测gsk-3β对nrf2/are结合活性的影响;qrt-pcr及westernblot法分别检测gsk-3β对are编码蛋白nqo1、ho-1mrna及蛋白表达的影响。结果:(1)构建大鼠mcao模型,再灌注1h时,gsk-3β、gsk-3β(p-tyr216)表达量下降;再灌注6h、24h时,gsk-3β、gsk-3β(p-tyr216)表达量增加。再灌注1h时,β-catenin、nrf2表达量增加,再灌注6h、24h时,β-catenin、nrf2表达量减少。再灌注6h为gsk-3β再次被活化的时间点。(2)gsk-3βsirna/活性阻滞后,不构建mcao模型,gsk-3β、gsk-3β(p-tyr216)蛋白表达量减少、gsk-3βmrna量也减少;总nrf2、细胞核内nrf2蛋白表达量及mrna量均无明显变化。(3)gsk-3βsirna/活性阻滞后,构建mcao模型,再灌注6h后,gsk-3β、gsk-3β(p-tyr216)蛋白表达量减少、gsk-3βmrna量也减少;总nrf2蛋白表达量及mrna量均增加,同时细胞核内nrf2蛋白表达量也增多;are与nrf2结合活性增加;ho-1、nqo1蛋白表达量与mRNA量均增加。结论:活化的GSK-3β在大鼠脑缺血再灌注损伤中能够下调Nrf2,对Nrf2/ARE信号通路起负性调控作用。