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目的:在口腔颌面部缺损的临床修复工作中,多采用自体骨移植进行治疗。但目前仍存在手术复杂,对取材部位有二次损伤,易引发炎症、排异反应等缺点,亟待优化。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是干细胞的一类,拥有可以定向进行成骨分化,并且可以通过旁分泌促进骨缺损部位血管化,加速骨愈合的潜力。且具有取材方便、易培养、免疫原性低、易于处理和在宿主体内可长期存活的特点。或许可以解决目前组织工程骨植入后因缺血而无法促进骨再生的临床治疗难点。远端无同源盒2基因（DLX2）是DLX同源盒基因家族家族成员之一,在生物体发育中有重要的调控作用。近年来DLX2可被多个信号刺激,在体外可促进成骨分化,并加速体内骨形成,但DLX2参与调控成骨过程的具体上下游分子机制尚未明晰,需要进一步研究。本课题在成功分离获取人源BMSCs后,以DLX2为研究对象,探索其在hBMSCs成骨诱导过程中对hBMSCs成骨分化和促血管生成能力的调控作用及上下游分子机制,拟通过本研究,确定DLX2对间充质干细胞成骨分化和血管再生的能力和机制,为组织工程支架的临床转化提供一定的科学指导意义和应用价值。方法:1.分离提取人骨髓来源间充质干细胞（hBMSCs）,流式细胞仪检测BMSCs表面干性标志物（CD29、CD34、CD44、CD45、CD90）。利用商业化定向诱导分化试剂盒培养诱导BMSCs。利用qRT-PCR检测成骨标志物（OCN、BSP、RUNX2、ALP）,ALP酶活检测、茜素红染色鉴定钙结节形成,油红O染色观察脂滴形成,阿尔新蓝染色观察软骨糖原形成,对BMSCs的成骨、成脂、成软骨多向分化潜力进行鉴定。同时,获取BMSCs条件培养基后与血管内皮细胞（HUVECs）共培养,运用成管实验和CD31荧光染色实验观察BMSCs对促血管生成的调控作用。2.对BMSCs进行成骨诱导培养,qRT-PCR、WB技术检测DLX2 mRNA和蛋白的表达变化。对BMSCs细胞进行DLX2敲降质粒转染,qRT-PCR、WB、ALP酶活检测及茜素红染色观察敲降DLX2对BMSCs成骨分化过程的影响;利用qRT-PCR、CHIP、WB实验验证DLX2对Wnt1及其下游Wnt1/GSK3β/β-catenin通路相关分子的影响。利用DLX2过表达质粒及Wnt/β-catenin通路抑制剂FH535建立回复验证体系,qRT-PCR、WB、ALP酶活性检测及茜素红染色,观察相关指标变化。完整验证DLX2是否通过激活Wnt/β-catenin通路参与BMSCs成骨分化过程。3.利用shDLX2和Wnt/β-catenin通路激动剂HLY78对BMSCs细胞进行处理。一方面,对处理后的细胞进行qRT-PCR、WB、ELISA实验检测,观察DLX2和Wnt/β-catenin通路的干预对BMSCs表达和分泌促血管生成因子（VEGFA、bFGF、TGFβ1、MMP2、MMP9）的影响;另一方面,收集处理后各组BMSCs的条件培养基对HUVECs细胞进行处理,进行成管实验观察对HUVECs成管能力的影响,并利用WB手段,检测HUVECs细胞中血管生成相关标志物（CD31、CDH5、vWF、VEGFR2）的表达改变。验证DLX2是否通过Wnt/β-catenin通路参与BMSCs对血管生成的调控过程。4.对BMSCs进行成骨分化诱导,qRT-PCR检测成骨分化诱导过程中lncRNA HOTTIP表达变化规律。利用lncRNA HOTTIP沉默质粒产品（shHOTTIP）敲降BMSCs细胞内的lncRNA HOTTIP表达水平,并利用qRT-PCR、WB、ALP酶活性检测、茜素红染色、ELISA,及成管实验观察lncRNA HOTTIP敲降对DLX2的表达及DLX2介导的BMSCs成骨分化和促血管生成过程的影响。利用RIP、RNA pulldown,及RNA降解实验,观察lncRNA HOTTIP对TAF15的招募作用,及二者与DLX2结合作用与对DLX2 mRNA稳定性的影响。最后,利用DLX2过表达质粒与shHOTTIP共同建立回复实验体系,利用qRT-PCR、WB、茜素红染色、ELISA,及成管实验观察验证lncRNA HOTTIP是否通过DLX2-Wnt/β-catenin通路参与BMSCs成骨分化及对血管生成的调控过程。结果:1.本实验提取人BMSCs在常规培养条件下呈贴壁生长状态,且表面标志物CD29、CD44、CD90高表达,同时CD34、CD45低表达,符合报道标准。茜素红、油红O、阿尔新蓝染色实验证明所获BMSCs在体外诱导培养下可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。对成骨诱导第0/1/3/7/14d的BMSCs细胞进行qRT-PCR及ALP酶活检测可以观察到细胞内OCN、BSP、RUNX2、ALP的表达,以及ALP酶活性均随诱导时间的增加而升高。最后成管实验和CD31荧光染色结果显示BMSCs对HUVECs细胞的成管能力有一定的促进作用,结果与文献报道一致。可以在后续的实验中继续使用。2.qRT-PCR及WB结果说明在BMSCs细胞的成骨诱导过程中DLX2的表达随诱导时间的延长而升高。敲降DLX2后再进行成骨诱导培养,qRT-PCR、WB、ALP酶活检测及茜素红染色结果显示,DLX2的表达下调可以抑制成骨诱导对BMSCs细胞内OCN、BSP、RUNX2、ALP的表达,ALP酶活性,以及细胞钙结节形成的促进作用。qRT-PCR及CHIP实验说明DLX2沉默可以抑制Wnt1的表达,且DLX2可以与Wnt1相结合。WB结果说明DLX2可以促进Wnt1的表达,GSK3β的磷酸化及β-catenin的表达和核转位。而Wnt1 sh RNA可以逆转这一作用。回复实验的结果也证实,Wnt/β-catenin通路抑制剂（FH535）的使用,可以有效逆转DLX2对Wnt/β-catenin信号通路活化及BMSCs成骨分化的促进作用。3.qRT-PCR及WB显示,shDLX2对DLX2本身及β-catenin表达的抑制作用,可以被Wnt/β-catenin通路激动剂（HLY78）抵消。WB、ELISA和成管实验结果显示,shDLX2可以抑制BMSCs表达和分泌VEGFA、bFGF、TGFβ1、MMP2、MMP9。处理后的BMSCs培养基则可进一步抑制HUVECs细胞中CD31、CDH5、vWF、VEGFR2的表达并最终抑制HUVECs细胞的成管能力。而这些作用可以被HLY78的加入所抵消。4.qRT-PCR及WB结果说明在BMSCs细胞的成骨诱导过程中lncRNA HOTTIP的表达随诱导时间的延长而升高。qRT-PCR、WB、ALP酶活检测、茜素红染色、ELISA,及成管实验结果显示lncRNA HOTTIP沉默可以抑制成骨诱导对BMSCs细胞中DLX2、OCN、BSP、RUNX2、ALP的表达,ALP酶活性,以及细胞钙结节形成的促进作用;并抑制BMSCs中VEGFA、bFGF、TGFβ1、MMP2、MMP9的表达与分泌,和最终HUVECs细胞中CD31、CDH5、vWF、VEGFR2的表达和细胞的成管能力。RIP、RNA pulldown实验证实了,lncRNA HOTTIP对TAF15的招募作用及二者与DLX2 RNA存在结合调控能力。RNA稳定性实验结果证明,lncRNA HOTTIP/TAF15与DLX2的结合作用可以提高DLX2的RNA稳定性。最后利用shHOTTIP和DLX2过表达质粒建立的回复实验结果说明,DLX2的过表达可以逆转抵消shHOTTIP对BMSCs细胞中DLX2、OCN、BSP、RUNX2、ALP的表达,ALP酶活性,以及细胞钙结节形成的抑制作用;以及对BMSCs中VEGFA、bFGF、TGFβ1、MMP2、MMP9的表达与分泌,和最终HUVECs细胞中CD31、CDH5、vWF、VEGFR2的表达和细胞的成管能力的抑制作用。结论:1.成功分离获取的人BMSCs具有多向分化潜能,同时,具有成骨分化和促血管生成的能力。2.BMSCs成骨分化过程中,DLX2呈高表达,且可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进成骨。3.BMSCs细胞内DLX2表达升高,可通过Wnt/β-catenin信号通路和旁分泌血管生成因子促进微环境中血管内皮细胞的活化,及血管生成。4.上游lncRNA HOTTIP可以通过招募转录因子TAF15,结合并提高DLX2RNA稳定性,激活其转录表达。最终通过对DLX2表达的促进作用,参与促进BMSCs的成骨分化及血管生成能力。