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背景:干细胞(MSC)移植治疗是脑损伤(包括缺血性脑卒中)治疗研究热点并呈乐观疗效,然而其作用机制不甚明确。近期研究表明,干细胞分泌的外泌体(Exos)对多种疾病模型疗效明显,提示MSC-Exos可能是干细胞移植治疗缺血性脑卒中新机制之一。已知小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)炎症反应主要参与细胞且于脑损伤后其功能活跃,故本研究拟以人脐带间充质干细胞(hUMSC)作为移植治疗细胞源,以脑卒中模型为治疗对象,从脐干细胞外泌体(hUMSC-Exos)与小胶质细胞的关联性着手,探讨hUMSC-Exos及小胶质细胞在脑卒中进程中的修复作用与相关机制。目的:探讨hUMSC-Exos对缺血性脑卒中后小胶质细胞介导神经炎症反应的调控与机制。研究内容与方法:1.hUMSC的培养、扩增及鉴定,和Exos的分离、鉴定(1)流式细胞术对hUMSC表面marker的检测鉴定;(2)100 000 g超速离心方法分离hUMSC培养上清外泌体,电镜、NTA、Western Blot(WB)检测Exos是否符合外泌体的鉴定标准;2.探索hUMSC-Exos对卒后小胶质细胞炎症的影响(1)体内探索hUMSC-Exos对卒中、炎症反应以及小胶质细胞炎症反应的影响。C57BL/6小鼠分为假手术组(Sham组)、手术组+PBS组(Vehicle组)、手术+Exos治疗组(hUMSC-Exos组),后两组进行大脑中动脉闭塞法(MCAO)诱导血性脑卒中模型;对hUMSC-Exos组进行静脉注射hUMSC-Exos 250 μ l PBS稀释50 μ g的Exos、对Vehicle组行注射250ul PBS作为对照;72小时后,对比检测各组的神经功能评分、TTC染色检测脑梗塞体积、HE染色,免疫组化分析炎症蛋白白介素6(IL-6)、核因子kB(NF-kB)的表达,免疫荧光检测M1、M2型小胶质细胞分别表达IBA1+CD16、IBA1+CD206情况,ELISA检测损伤侧大脑促炎因子IL-6、肿瘤坏死因子(TNF-a)、白介素1b(IL-1b)表达情况。(2)体外实验探索hUMSC-Exos对糖氧剥夺(OGD)模型激活小胶质细胞炎症反应的影响;PKH26标记Exos,与小胶质细胞BV2共培养6小时,观察小胶质细胞对Exos的摄取情况。将小胶质细胞分为不做处理的对照组(Con组)、实验模型组(OGD组)、模型加外泌体组共培养组(OGD+hUMSC-Exos组),分别以qPCR和ELISA方法检测细胞及细胞上清中IL-6、TNF-a、IL-1b的表达情况。3.探索hUMSC-Exos中的miR-146a-5p介导IRAK/TRAF6通道对小胶质细胞炎症反应的研究(1)探索Exos中的miRNAs对小胶质细胞炎症反应的的作用。小干扰RNA(siRNA)干扰miRNAs合成关键蛋白Drosha,收集外泌体做体外的功能实验;在体外实验小胶质细胞分为不做任何处理的空白对照组(Control组)、OGD模型组(OGD组)、OGD模型加si-Drosha空白载体外泌体共培养对照组(Exossi-Control组)、OGD模型加si-Drosha干扰hUMSC的外泌体共培养组(Exossi-Drosha组),利用qPCR、ELISA方法分别检测细胞转录水平中和上清中IL-6、TNF-a、IL-1b的表达情况。(2)对hUMSC-Exos进行miRNA二代测序,在表达前十中选出miR-146a-5p进行机制研究。以慢病毒载体介导的shRNA抑制hUMSC的miR-146a-5p,扩增培养收集外泌体进行后续细胞、动物功能实验。(3)在体外试验中,小胶质细胞BV2分为对照组(Con组)、模型组(OGD组)、小胶质细胞OGD模型加hUMSC-Exos共培养组(OGD+Exos组)、小胶质细胞OGD模型加miR-146a-5p敲低的外泌体共培养组(OGD+miR-146a-5p k/d Exos组)以及小胶质细胞OGD模型加miR-146a-5p空载的外泌体共培养组(OGD+miR-cn Exos组),通过WB检测细胞中IL-6,IL-1b和TNF-α以及信号通路 IRAK1,TRAF6和p-NF-κ(p-p65)的表达情况,利用 qPCR、ELISA方法分别检测细胞转录水平和上清中IL-6、TNF-a、IL-1b的表达情况。(4)体内实验探索hUMSC-Exos中的miR-146a-5p对卒中、炎症反应以及小胶质细胞炎症反应的影响。C57BL/6小鼠分为MCAO模型尾静脉注射miR-146a-5p敲低的外泌体组(miR-146a-5p k/d Exos组)和MCAO模型尾静脉注射miR-146a-5p空载的外泌体对照组(miR-CN Exos组);对miR-146a-5p k/d Exos组每只小鼠进行静脉注射miR-146a-5p k/d Exos 250ul含50ug的外泌体悬液、对进miR-CN Exos组行注射miR-CN Exos 250ul含50ug的外泌体悬液作为对照,72小时后,对比检测各组的神经功能评分、TTC染色检测脑梗塞体积、免疫组化分析IL-6、NF-kB的表达、免疫荧光检测M1小胶质细胞的的表达情况、WB检测TRAF6,IRAK1,p-p65的表达情况、以及ELISA检测损伤侧大脑IL-6、TNF-a、IL-1b表达情况。结果:1.(1)hUMSC 的流式结果 CD73(100%),CD105(99.96%)和 CD90(100%)呈阳性,CD45(0.06%),HLA-DR(0.50%),CD34(0.06%),CD11b(0.06%)和CD9(0.46%)呈阴性,提示本研究使用的hUMSC符合MSC鉴定标准;(2)外泌体为双层膜酒托状的典型形态,粒径大小主要集中在30～150 nm,CD9、Alix和TSG101外泌体标志蛋白均表达,说明hUMSC分泌外泌体,且本研究收集到的外泌体符合外泌体鉴定标准,奠定了后续研究基础;2.(1)在体内实验中,与Vehicle组相比,hUMSC-Exos组小鼠神经功能行为的的恢复显著(p<0.01),脑梗塞体积减少显著(p<0.05),组织和细胞水肿减少显著,组织中IL-6、NF-kB的表达减少显著(p<0.05),M1型小胶质细胞IBA-1+CD16标志物减少显著(p<0.05)、但M2型小胶质细胞IBA-1+CD206增加显著(p<0.05),损伤脑组织的IL-6、TNF-a、IL-1b的表达显著减少(p<0.05);(2)观察到小胶质细胞摄取外泌体;与体外实验的OGD组比,hUMSC-Exos组的小胶质细胞中IL-6、TNF-a、IL-1b的转录水平显著降低(p<0.01),以及上清中IL-6、TNF-a、IL-1b的量也显著降低(p<0.01);揭示hUMSC-Exos保护脑卒中,减轻卒中后的炎症反应以及小胶质细胞的促炎反应。3.(1)与Exossi-Control对照组相比,Exossi-Drosha组中的小胶质细胞中的IL-6、TNF-a、IL-1b的转录水平显著下降(p<0.05),小胶质细胞上清中的IL-6、TNF-a、IL-1b 的量也显著降低(p<0.05);(2)miR-146a-5p 为 hUMSC-Exos 的 miRNA二代测序表达排序前十兴趣分子;(3)在体外实验中,与OGD+Exos组、OGD+miR-cn Exos 组相比,OGD+miR-146a-5p k/d Exos 组的 IL-6,IL-1b 和 TNF-α以及信号通路IRAK1,TRAF6和p-NF-κ B(p-p65)在小胶质细胞中的表达均升高(p<0.01),转录水平和细胞上清中的IL-6、TNF-a、IL-1b也显著升高;(4)在体内实验中,与miR-cn Exos组相比,miR-146a-5p k/d Exos组小鼠神经功能行为恢复较差(p<0.01),脑梗塞较严重(p<0.05),炎症蛋白IL-6、NF-kB在损伤脑组织的表达较高(p<0.05),损伤侧脑组织中M1型小胶质细胞标志物IBA-1+CD16表达较多(p<0.05)、IRAK1、TRAF6 的表达也较多(p<0.05),以及IL-6、TNF-a、IL-1b在损伤侧脑组织的表达较多。揭示hUMSC-Exos中的miR-146a-5p抑制IRAK/TRAF6通路减轻小胶质细胞的炎症反应。结论:hUMSC-Exos减轻缺血性脑卒中的损伤通过miR-146a-5p抑制小胶质细胞的IRAK1/TRAF6信号通路来减轻小胶质细胞介导的炎症反应,干细胞外泌体替代干细胞治疗CNS损伤具一定可能性。