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研究背景:肺炎链球菌是引起脑膜炎、败血症、菌血症性肺炎等侵袭性疾病以及中耳炎、鼻窦炎等非侵袭性疾病最为常见的一种病原体,在全球范围内每年大约有160万人死于肺炎链球菌疾病,其中大部分来自发展中国家。目前,市场上预防肺炎链球菌疾病的疫苗有两类,一类是23价多糖疫苗,另一类是7价和13价多糖蛋白结合疫苗,前者对于2岁以下儿童、免疫缺陷患者和老人保护性弱,后者包含的血清型有限且易引起血清型替换。因此,研制一种无血清型限制的新型肺炎链球菌疫苗势在必行;肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)是存在于所有肺炎链球菌表面高度保守的蛋白,是一种理想的候选抗原;肺炎链球菌在人类主要定植于鼻咽部,通过咽鼓管途径进入中耳引起急性中耳炎,通过呼吸道进入肺部引起肺炎,进而有可能通过血流引起菌血症和脑膜炎,因此局部的黏膜免疫反应对于预防肺炎链球菌感染至关重要;黏膜免疫是一种有效的诱发局部免疫力的策略,然而鼻黏膜表面富含的纤毛、粘液,分泌的蛋白核酸酶以及上皮屏障使得抗原很难吸收,需要合适的黏膜输送系统或佐剂,壳聚糖(chitosan)是一种有效的黏膜输送系统,与蛋白或核酸结合形成纳米颗粒,有利于抗原的吸收。因此,在本项研究中采用chitosan作为PsaA蛋白和核酸的黏膜输送系统。 目的:研究chitosan包裹PsaA重组蛋白或核酸形成的纳米颗粒经鼻腔黏膜途径免疫在BALB/c小鼠体内诱导的特异性免疫应答能力以及对肺炎链球菌急性中耳炎、败血症和鼻咽部定植的保护作用。共分三部分:(1)壳聚糖包裹的PsaA重组蛋白纳米颗粒的制备及黏膜免疫诱生特异性免疫应答研究;(2)黏膜免疫chitosan-PsaA纳米颗粒预防急性中耳炎和败血症研究;(3)黏膜免疫壳聚糖包裹的PsaADNA纳米颗粒预防肺炎链球菌鼻咽部定植作用研究。 方法:(1)chitosan-PsaA纳米颗粒的制备:PCR法从肺炎链球菌基因组扩增PsaA基因,与pET28a构建重组原核表达质粒pET28a-psaA,以其转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达PsaA蛋白,亲和层析获得纯化的PsaA蛋白,westernblot鉴定其抗原性;采用离子交联技术制备chitosan-PsaA纳米颗粒,并检测其粒径及电位;(2)鼻腔接种chitosan-PsaA纳米颗粒诱生免疫应答研究:将制备的chitosan-PsaA纳米颗粒、裸PsaA蛋白(nPsaA)、chitosan分别鼻腔免疫BALB/c小鼠,收集鼻腔灌洗液(nasalwashes)、中耳灌洗液(MEL)及支气管肺泡灌洗液(BALF)检测特异性IgA抗体反应;收集血清,检测特异性IgG抗体反应;分离并培养脾细胞,检测IL-17A、IL-4及IFN-γ的分泌水平;(3)chitosan-PsaA纳米颗粒预防急性中耳炎研究:以chitosan-PsaA纳米颗粒、裸PsaA蛋白(nPsaA)、chitosan分别鼻腔免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2周,小鼠中耳听泡注射14型肺炎链球菌,分别于攻毒后3天和7天进行中耳菌落计数及中耳组织病理学检查,并收集中耳支气管肺泡灌洗液;(4)chitosan-PsaA纳米颗粒预防败血症研究:以chitosan-PsaA纳米颗粒、裸PsaA蛋白(nPsaA)、chitosan分别免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2周,腹腔分别注射3型和14型肺炎链球菌,观察小鼠21天内的存活率;(5)黏膜免疫保护机制探讨:检测小鼠免疫血清中特异性抗体的结合功能、抑制黏附功能以及调理吞噬功能;双抗夹心法检测免疫小鼠中耳攻毒前、攻毒后3天和7天支气管肺泡灌洗液中IL-17A水平;(6)黏膜免疫壳聚糖包裹的PsaADNA纳米颗粒预防肺炎链球菌鼻咽部定植作用研究:PCR法从3型肺炎链球菌基因组扩增Psa,A基因,与pVAX1构建真核表达质粒pVAX1-psaA,RT-PCR及Westernblot鉴定pVAX1-psaA在体外真核细胞中的表达;复凝聚法制备chitosan-psaA纳米颗粒,并检测其粒径及电位大小,通过与DnaseⅠ共培养评估chitosan保护DNA免遭降解的能力;用制备好的chitosan-psaA纳米颗粒、pVAX1-psaA(nakedpsaA)、chitosan-pVAX1分别免疫BALB/c小鼠,每两周一次,连续4次,末次免疫后2周,收集鼻腔、中耳及支气管肺泡灌洗液检测特异性IgA抗体反应;收集血清检测特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体反应;分离并培养脾淋巴细胞,检测IL-17A及工FN-γ的分泌水平;鼻腔滴入3型肺炎链球菌,5天后通过菌落计数评估各免疫组对肺炎链球菌鼻咽部定植的保护作用;收集鼻腔攻毒前及攻毒5天后的支气管肺泡灌洗液,通过双抗夹心法检测IL-17A水平。 结果:(1)从肺炎链球菌基因组成功扩增PsaA编码序列,经测序鉴定与GenBank中序列一致,成功构建pET28a-psaA原核表达质粒,并利用原核表达系统获得了可溶性的PsaA蛋白,经Westernblot证实PsaA蛋白具备抗原性;成功制备了大小平均为691nm、表面电位为+21.1mV的chitosan-PsaA纳米颗粒;(2)chitosan-PsaA组鼻腔黏膜免疫获得了较高水平的全面免疫应答:鼻腔、中耳和支气管肺泡灌洗液中特异性IgA抗体水平明显高于nPsaA和chitosan组(P＜0.05);血清中特异性IgG抗体水平明显高于nPsaA和chitosan组(P＜0.05);经PsaA抗原刺激后脾细胞分泌的IL-17A、IL-4及IFN-γ水平明显高于nPsaA和chirosan组(p＜0.05);(3)评估chitosan-PsaA纳米颗粒对急性中耳炎的保护作用结果表明,攻毒后3天chitosan-PsaA纳米颗粒组中耳的菌落计数明显少于nPsaA和chitosan组(P＜0.05),而攻毒后7天chitoan-PsaA组小鼠均无细菌定植,与chitosan组相比明显减少(P＜0.05),nPsaA组4只小鼠有细菌定植,chitosgtn组6只小鼠有细菌定植;攻毒后3天和7天chitoan-PsaA组鼓膜的厚度和中耳炎症细胞数均少于nPsaA和chitosan组(P＜0.05);(4)评估chitosan-PsaA纳米颗粒预防败血症的研究结果表明,chitosan-PsaA组3型14型肺炎链球菌小鼠的存活率均为100％,与nPsaA和chitosan组相比差异具有统计学意义(P＜0.05),证实了该PsaA疫苗具有交叉保护性;(5)抗体功能实验表明chitosan-PsaA组小鼠的血清抗体有较高的抗体结合功能、抑制黏附功能和调理吞噬功能,参与了黏膜保护机制;黏膜局部IL-17A水平在小鼠中耳攻毒3天开始升高,7天明显升高,chitosan-PsaA组与nPsaA和chitosan组相比有明显更高水平的IL-17A(P＜0.05);(6)成功构建了pVAX1-psaA真核表达载体,经RT-PCR和Westernblot鉴定该质粒可以在体外培养的真核细胞中表达;制备了平均大小为392nm、表面电位为+12.5mY的chitosan-psaA纳米颗粒,该纳米颗粒具有保护pVAX1-psaA免遭DnaseⅠ降解作用;chitosan-psaA免疫组在小鼠体内诱导产生的血清中PsaA特异性IgG、IgG1、IgG2a、粘膜IgA抗体水平及IL-17A、IFN-γ水平与裸psaA组及chitosan-pVAX1组相比均明显升高,且差异具有统计学意义(P＜0.05);chitosan-psaA组较裸psaA组及chitosan-pVAX1组小鼠肺炎链球菌鼻咽部的定植量明显降低(P＜0.05);鼻腔攻毒前黏膜IL-17A水平较低,攻毒后IL-17A水平升高,chitosan-psaA免疫组明显高于裸psaA组及chitosan-pVAX1组(P＜0.05),提示IL-17A可能参与了局部黏膜免疫,有利于肺炎链球菌从鼻咽部的清除。 结论:chitosan不论包裹PsaA蛋白疫苗还是核酸疫苗均能形成纳米颗粒,该纳米颗粒能够诱导实验动物特异性体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫应答,并对肺炎链球菌导致的急性中耳炎、败血症和鼻咽部的细菌定植具有保护作用;本研究获得的chitosan-PsaA和chitosan-psaA纳米颗粒是一种有效的黏膜免疫疫苗,以其黏膜免疫可望应用于肺炎链球菌感染的防治研究,该免疫策略研究为新一代肺炎链球菌疫苗的设计提供了实验基础。