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氮素作为植物必需的矿质营养元素之一,是合成蛋白质、核酸和一些辅助因子等含氮化合物的必需组分。铵离子是植物根系吸收的最为经济有效的一种氮素形式。植物细胞膜上铵转运蛋白（ammonium transporters,AMTs）是植物根系吸收和转运铵根离子的重要载体,其对体内铵根离子平衡的调节是细胞能正常进行各种生理活动的基础。拟南芥中AMTs家族共有6个成员,其中AMT1;3仅在根部特异性表达,负责根部铵根离子的吸收和转运。近有研究表明,泛素化修饰不但调控蛋白的降解,还作为膜蛋白内化信号参与蛋白的胞吞、内涵体中蛋白分选等过程。然而泛素化修饰是否调控铵转运蛋白AMT1;3的胞吞及囊泡转运机制尚不十分明确,特别是对其动力学特征变化规律的研究仍十分匮乏。本研究在克隆了拟南芥AMT1;3基因的基础上,获得了泛素化位点发生突变的AMT1;3K75RK233R-EGFP转基因拟南芥植株。运用激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope,LSCM）、可变角度全内反射荧光显微镜（variable-angle total internal reflection fluorescence microscope,VA-TIRFM）以及荧光相关光谱（fluorescence correlation spectroscopy,FCS）等活细胞显微技术结合生物化学及分子生物学技术,在高铵胁迫条件下对AMT1;3K75RK233R-EGFP转基因拟南芥植株进行研究,主要对AMT1;3蛋白在质膜上的分布、运动模式、动力学参数、胞吞程度以及囊泡转运途径展开了较为深入的探讨。得到的主要结果如下:1.AMT1;3铵转运蛋白的降解途径分析:（1）通过免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）实验富集AMT1;3蛋白,发现AMT1;3在植物体内存在一个本底水平的泛素化修饰。（2）对拟南芥中铵转运蛋白AMT1;3的稳态变化水平进行分析,发现高铵胁迫下AMT1;3会在胞质中发生降解。运用高铵胁迫及26S蛋白酶体抑制剂MG132共处理AMT1;3-EGFP转基因拟南芥,发现AMT1;3蛋白的降解受到抑制,表明泛素化修饰参与高铵胁迫下AMT1;3蛋白的降解。2.AMT1;3K75RK233R-EGFP突变体的获得:根据拓扑学结构对AMT1;3铵转运蛋白可能发生泛素化的赖氨酸位点进行预测,成功将其突变为精氨酸,获得AMT1;3K75RK233R-EGFP泛素化位点突变体材料。3.泛素化修饰对AMT1;3蛋白动力学参数的影响:AMT1;3在质膜上存在布朗运动、定向运动、受限运动以及混合运动等四种运动模式,其中布朗运动占比例最高,且泛素化修饰对AMT1;3在质膜上的运动模式无显著影响。高铵胁迫条件下,突变体植株AMT1;3K75RK233R-EGFP中AMT1;3蛋白的扩散系数显著降低,长距离扩散所占的比例显著降低,运动速率显著上升,表明在高铵胁迫下泛素化缺失影响AMT1;3在细胞质膜上的运动状态。4.泛素化修饰影响AMT1;3蛋白的胞吞:正常铵处理条件下AMT1;3-EGFP以及AMT1;3K75RK233R-EGFP突变体植株中AMT1;3蛋白的胞吞无明显差异,而在高铵胁迫条件下AMT1;3K75RK233R-EGFP突变体中AMT1;3蛋白的胞吞受到极显著的抑制,表明泛素化修饰影响高铵胁迫条件下AMT1;3蛋白的胞吞。5.泛素化修饰对铵转运蛋白AMT1;3囊泡转运途径调控的研究:构建AMT1;3-EGFP和AMT1;3K75RK233R-EGFP分别与细胞内膜系统标记株系VHA-a1-m RFP、At SNX1-m RFP、m RFP-SYP22杂交的拟南芥材料。在高铵胁迫条件下,突变体植株中AMT1;3蛋白主要聚集在早期内涵体（early endosome,EE）中,减少向晚期内涵体（late endosome,LE）的转运以及液泡中的降解,表明植物AMT1;3蛋白在高铵胁迫条件下其胞内循环与降解平衡机制受到影响。综上所述,本论文应用了多种光学成像技术结合生化及分子生物学手段,以AMT1;3K75RK233R-EGFP突变体拟南芥的根尖伸长区为研究对象,在高铵胁迫处理条件下对AMT1;3蛋白的动力学特征、胞吞程度以及囊泡转运过程的变化进行了分析。研究发现:在高铵胁迫条件下,泛素化修饰参与AMT1;3蛋白的降解;AMT1;3在细胞质膜上的运动是高度动态的,泛素化修饰通过改变AMT1;3蛋白在质膜上的动力学从而影响对外界铵的吸收与转运;高铵胁迫条件下,泛素化修饰的缺失抑制了AMT1;3蛋白的胞吞,导致大部分的蛋白滞留在质膜上;通过对AMT1;3蛋白在细胞内的转运过程进行研究,发现在高铵胁迫下泛素化修饰降低了AMT1;3蛋白进入液泡中降解的比例,导致其囊泡循环与降解平衡机制受到影响。以上研究成果表明泛素化修饰引发高铵胁迫下铵转运蛋白AMT1;3在细胞质膜上运动状态、胞吞程度以及囊泡转运过程的变化。这些结果为进一步揭示泛素化修饰参与调控铵转运蛋白活性的分子机制,阐明铵转运蛋白活性调控的机理提供新的理论依据。