论文部分内容阅读
禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)的毒力因子致病性复杂。其可通过内毒素(LPS)损伤鸡肠道,破坏上皮组织,诱导应答基因的防御性表达,而应答基因的表达水平与APEC的自身致病力有很大关系。PhoP/Q二元调控系统是一种广泛存在于革兰氏阴性菌中调控细菌毒力和许多细胞活性的信号传导调控系统,有关研究表明PhoP/Q二元调控系统在调控APEC致病力方面发挥着重要作用。本实验研究了PhoP/Q基因缺失对禽致病性大肠杆菌生物学特性及毒力的影响,并应用基因芯片从转录水平比较野生株和缺失株的基因表达差异,筛选PhoP/Q二元调控系统可能调控的毒力基因,同时采用高通量RNA-Seq技术筛选出APEC与PhoP/Q基因缺失株感染雏鸡小肠后的应答基因,进一步揭示了PhoP/Q二元调控系统与APEC致病力之间的关系。具体研究内容和结果如下:1、禽致病性大肠杆菌PhoP/Q基因缺失对其生物学特性及毒力的影响本研究分别通过菌体超微结构的观察实验、过氧化氢敏感性实验、血清杀菌学实验和组织载菌量实验探索PhoP/Q基因缺失对APEC生物学特性和毒力的影响。结果表明,缺失PhoP/Q基因影响细菌菌毛的表达,但在过氧化氢敏感性实验和鸡血清的补体杀菌实验中无明显差异。组织载菌量实验结果显示,AE17在感染雏鸡的肝和脾的细菌载菌量分别为1.72×10~7 CFU/g和2.23×10~7CFU/g。然而,在PhoP/Q缺失株中肝和脾的细菌载菌量分别为1.37×10~5 CFU/g和4.23×10~6CFU/g,与野生株相比PhoP/Q缺失株在肝脾中的载菌量减少。2、运用基因芯片筛选禽致病性大肠杆菌PhoP/Q调控的毒力基因为探索PhoP/Q二元调控系统可能调控的毒力基因。应用基因芯片技术,从转录水平比较野生株和缺失株之间差异基因转录情况。结果显示,与野生株相比,PhoP、PhoQ和PhoP/Q基因敲除株三株共同变化的差异基因共292个,其中170个上调,122个下调,GO(Gene Ontology)分类结果显示,这些基因主要参与包括生物调节、细胞过程、新陈代谢过程、细胞部分膜、结合、催化活性、电子载体活动、酶调节活动、受体活动、结构分子活性、转录调节活动和转运活动。通过实时荧光定量PCR技术对其中7个差异基因的转录进行检测,结果与表达谱芯片一致。3、RNA-Seq筛选APEC和PhoP/Q缺失株感染雏鸡肠道的应答基因为筛选AE17菌株与PhoP/Q缺失株感染雏鸡小肠差异表达的免疫应答基因,应用高通量RNA-Seq技术筛选出AE17与PhoP/Q缺失株感染雏鸡小肠后的差异表达基因,进行了生物信息学GO功能分类和KEGG信号通路分析,并利用荧光定量PCR验证了部分差异表达基因。野生株攻毒组与对照组相比筛选出的差异表达基因共有131个差异基因,其中上调的差异基因有74个,下调的差异基因有57个。GO分类结果显示,这些基因主要涉及到蛋白结合、免疫反应和转运活动等功能。KEGG分析这些差异表达基因参与PPAR、新陈代谢、细胞因子受体相互作用,Jak-STAT、RIG-I-样受体和吞噬体等信号通路。缺失株攻毒组与对照组相比筛选出的差异表达基因共有172个,其中上调的差异基因有93个,下调的差异基因有79个。GO分类结果显示,这些基因主要涉及到氧化还原活动、转运活动、新陈代谢过程、免疫反应等功能。KEGG分析这些差异表达基因参与MAPK信号通路、粘着斑、PPAR、吞噬体和新陈代谢通路等。以上研究结果表明,PhoP/Q基因缺失影响禽致病性大肠杆菌菌毛的表达并降低肝脾的载菌量,表明二元调控系统PhoP/Q在APEC毒力作用中扮演重要角色。继而通过基因芯片分析PhoP/Q基因缺失引起的差异表达基因,结合生物信息学分析和文献报道,筛选出crcA、ompT、yrbL、ybjx、rstA、rstB、fliA、hsl J和degP等二元调控系统PhoP/Q可能直接调控的毒力基因。应用RNA-Seq技术筛选APEC与PhoP/Q缺失株感染雏鸡肠道后的差异表达的基因,筛选出MAdCAM-1、S100A9、CCL19、CCLI10、DDX3X、LEAP2、CALB1、SOCS3、MT4等可能抵抗APEC毒力的免疫应答基因,为进一步研究APEC的的致病作用及宿主抗病机制提供一些实验依据。