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目的：肌萎缩侧索硬化（amyotrophiclateralsclerosis,ALS）是一种选择性侵犯运动神经元的致命性、进行性神经系统变性疾病，表现为上、下运动神经元同时受损的混合性瘫痪,临床表现主要为缓慢进展的四肢无力，患者逐渐丧失运动功能，累及其呼吸肌，导致其因呼吸机麻痹或者并发呼吸道感染而死亡。ALS预后不良,罹患该病的患者，多于发病后3至5年内死亡。其发病机制至今尚未完全清楚,可能与神经突触内谷氨酸的兴奋毒性、氧化应激、神经营养因子缺乏、自身免疫反应等多种因素有关。目前利鲁唑是第一个成功延长患者生命的药物，可延缓ALS患者气管切开前时间,及肌无力的恶化程度。但利鲁唑不能逆转该病病程,并且价格昂贵，许多患者在用药过程中因为经济原因而不能坚持用完整个疗程，不利于疾病的治疗。丁苯酞（NBP）已应用于急性脑梗死的基础研究和临床治疗中，并取得了较好的效果。在其作用机制中，它除了能改善缺血区微循环和维护线粒体结构和功能以外，还能阻断缺血性脑损伤多个病理环节，亦能抑制细胞凋亡和谷氨酸的释放等，从而达到神经保护的作用。本实验旨在比较利鲁唑、丁苯酞、两药合用这三种不同给药方法对hSOD1G93A转基因鼠的运动功能及生存期的影响及疗效差别。转轮实验、脚印分析及抓力实验等行为学测定方法可从不同层面评估ALS小鼠的运动功能，而记录小鼠的存活天数则用于生存期的比较。通过统计不同组小鼠的上述指标，从而得到该病治疗方案的新启发。方法：1动物分组及给药方法hSOD1G93A转基因小鼠96只，随机分为丁苯酞+利鲁唑组（后称合用药组）、利鲁唑组、丁苯酞组、对照组，每组24只，雌雄各12只。将丁苯酞纯品稀释于实验专用玉米油中，制成180mg/ml的丁苯酞溶液备用，于小鼠6周龄时开始，按照180mg/kg的剂量对丁苯酞组小鼠进行灌胃，对照组给予同等量10ml/kg的玉米油，每天一次。利鲁唑组按照100ug/ml的浓度溶于小鼠的日常饮用水中，合用组小鼠在丁苯酞灌胃的同时饮用溶有利鲁唑的水。2行为学观察：每一组小鼠从第10周起每周进行行为学测定，于90天和120天时记录下数据，测试之前对小鼠进行5天的适应性训练。2.1转轮实验将小鼠放在直径为30mm的滚轴上，设定好参数后滚轴开始旋转，在180s内转速由1rpm逐渐增至30rpm，每只小鼠重复测定3次，记录下小鼠在滚轴上持续运动不掉落的时间（以秒计数），取最长的一次记录。2.2脚印测量将小鼠放入长50cm，宽5cm的木制凹槽里面，凹槽底面铺上长宽与之相当的纸带，用不同颜色墨汁涂染小鼠的后肢脚掌，使得其在纸带上跑动时能留下前后掌两种不同颜色的印迹。然后将小鼠放入凹槽的一端，驱赶小鼠前进使其运动到另一端，之后找出小鼠留在凹槽底纸带上的3个连续跑动时的脚印（刚起步时的脚印不选入测量），双侧脚印各测三个之间的两段距离，取平均数作为一侧步长值，然后取左右双侧步长的平均值记录。2.3抓力测定用手固定住小鼠背部，让小鼠后肢抓在抓力仪平板上，测定两侧后肢抓力值，每侧重复测定3次，取最高数值记录，然后取双侧数值的平均值作为统计数据录入。2.4判定发病时间将小鼠放在滚轴上设定好后开始旋转，在180秒内转速由1rpm逐渐增至30rpm，每只小鼠重复测定3次，在180秒内老鼠若掉落下来或者后肢明显震颤，发现当天记录为该鼠发病[1]，发病时间按小鼠从出生到发病的天数计算。2.5判定生存期将小鼠侧卧位放置于不光滑平板上，若小鼠不能在20秒内翻转，则判定该小鼠为死亡，当天记录为小鼠的死亡时间，生存期按小鼠从出生到死亡的天数计算[2]。3组织病理学用10%水合氯醛将小鼠麻醉后，心脏灌注4%多聚甲醛固定20min，取小鼠脊髓腰段以4%多聚甲醛固定48h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规组织切片。5μm厚的石蜡切片应用HE染色，观察脊髓前角神经元的存活情况，选取位于脊髓中央管后缘腹侧范围的前角内，符合直径＞25微米、核仁着色清晰、多角型的神经元计数[3]。4统计学分析所记录数据均以X±SEM来表示，应用统计软件SPSS13.0版进行统计学分析，用两个独立样本的秩和检验或者t检验方法进行两组间比较。病理学结果应用ANOVA方差分析或秩和检验方法进行分析，P<0.05提示差异具有统计学意义。结果:1SOD1基因鉴定子代转基因小鼠由尾端提取出的DNA，经过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳后：可见亮度不同条带，阳性SOD1小鼠的PCR产物为条带（236bp），如图（Fig.1）所见亮条带，此条带对应小鼠即为SOD1G93A转基因阳性小鼠。2各组小鼠的发病时间与生存期发病时间的比较：合用组、丁苯酞组及利鲁唑组小鼠发病时间分别为127.625±2.741天、118.261±2.420天、123.593±1.898天，与对照组106.875±2.298天相比，P值分别为0.000、0.003、0.000，均<0.05，具有统计学差异。合用组与丁苯酞组相比，P=0.011<0.05，有统计学差异；合用组与利鲁唑组相比，P=0.116>0.05，差异不具统计学意义；丁苯酞组和利鲁唑组相比，P=0.273>0.05，差异不具统计学意义。生存时间的比较：合用组、丁苯酞组及利鲁唑组小鼠生存时间分别为146.375±2.796天、138.870±2.235天、141.542±2.105天，与对照组124.500±2.354天相比，P值分别为0.000、0.003、0.000，均<0.05，具有统计学差异。合用组与丁苯酞组相比，P=0.028<0.05，有统计学差异；合用组与利鲁唑组相比，合用组略微优于丁苯酞组，P=0.086，没有统计学差异；丁苯酞组与利鲁唑组相比，P=0.465，没有统计学差异。见Fig2Table1。3行为学3.1转轮实验90天时，合用组、丁苯酞组及利鲁唑组转轮时间分别为180.000±0.000秒、180.000±0.000秒、180.000±0.000秒，与对照组170.875±6.928s相比，P值分别为0.153、0.162、0.153，均>0.05，不具统计学差异。合用组与丁苯酞组相比，P=1.000>0.05，两组间无统计学差异；合用组与利鲁唑组小鼠相比，P=1.000>0.05，两组相比无统计学差异；利鲁唑组与丁苯酞组小鼠相比，P=1.000>0.05，差异无统计学意义。120天时，合用组、丁苯酞组及利鲁唑组转轮时间分别为157.000、±8.530秒、123.826±11.411秒、160.833±7.235秒，与对照组61.167±12.266秒相比较，P值分别为0.000、0.000、0.000，均<0.05，均具统计学差异。合用组与丁苯酞组相比，P=0.031<0.05，两组相比有统计学差异；合用组与利鲁唑组小鼠相比，P=0.733>0.05，两组相比无统计学差异；利鲁唑组与丁苯酞组小鼠相比，P=0.023<0.05，差异有统计学意义。见Table2。3.2脚印分析：90天时，合用组、丁苯酞组及利鲁唑组的后肢步长分别是7.008±0.146、6.798±0.058、6.722±0.109，与对照组6.491±0.092相比，p值分别为0.002、0.016、0.136，合用组、丁苯酞组与对照组的p值均小于0.05，有统计学意义。利鲁唑组与对照组相比，P=0.136>0.05，无统计学意义；合用组与丁苯酞组小鼠相比，P=0.072>0.05，两组间无统计学差异；合用组与利鲁唑组小鼠相比，P=0.040<0.05，两组相比有统计学差异；利鲁唑组与丁苯酞组小鼠相比，P=0.784>0.05，差异无统计学意义。120天时，合用组、丁苯酞组和利鲁唑组小鼠的后肢步长分别为6.251±0.214、5.165±0.272、5.679±0.203，与对照组3.423±0.410相比，P值分别为0.000、0.002、0.000均<0.05，具统计学差异。合用组与丁苯酞组小鼠相比，P=0.003<0.05，两组相比有统计学差异；合用组与利鲁唑组小鼠相比，P=0.037<0.05，两组相比有统计学差异；利鲁唑组与丁苯酞组小鼠相比，P=0.159>0.05，差异无统计学意义。见Table3。3.3抓力实验90天时，合用组、丁苯酞组、利鲁唑组小鼠的后肢抓力分别为71.333±2.519、67.000±1.870、67.417±2.494，与对照组64.167±2.284相比较，P值分别为0.227、0.475、0.584，均>0.05，不具统计学差异。合用组与丁苯酞组相比，P=0.246>0.05，两组间无统计学差异；合用组与利鲁唑组小鼠相比，P=0.227>0.05，两组相比无统计学差异；利鲁唑组与丁苯酞组小鼠相比，P=0.265>0.05，差异无统计学意义。120天时，合用组、丁苯酞组、利鲁唑组小鼠的抓力分别为60.250±2.396、43.217±3.508、50.750±2.817，与对照组26.208±3.788相比较，P值分别为0.006、0.002、0.000，均<0.05，具统计学差异。合用组与丁苯酞组小鼠相比，P=0.001<0.05，两组间有统计学差异；合用组与利鲁唑组小鼠相比，P=0.006<0.05，两组相比有统计学差异；利鲁唑组与丁苯酞组小鼠相比，P=0.101>0.05，差异无统计学意义。见Table4。4病理学结果显示,在症状期（即120天）时，合用药组、丁苯酞组、利鲁唑组小鼠的脊髓前脚残存神经元数分别为16.53±2.264、11.40±1.844、12.87±3.137，与安慰剂组3.67±1.379相比，p值均=0.000<0.05，具统计学差异。三用药组之间两两比较：合用组与丁苯酞组、利鲁唑组比较，p值均=0.000<0.05，具统计学差异。而丁苯酞组与利鲁唑组之间比较，p值=0.068>0.05，没有统计学差异。结论：以上实验结果显示，丁苯酞在延长hSOD1G93A转基因小鼠的生存期，改善其运动功能方面具有与利鲁唑基本相同的作用。丁苯酞与利鲁唑合用在延长生存期方面并不优于利鲁唑，但在改善运动能力方面有些优势。