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慢性髓细胞性白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)是一种起源于造血干细胞的恶性增生性疾病,目前仍缺乏有效的治疗方法,复发的根源是白血病微小残余病变(minimal residue disease, MRD)。利用T细胞进行过继性免疫治疗,是治疗病毒感染性疾病和肿瘤的理想方法,但是用于治疗的T细胞的特异性、亲和性、分化水平和数量等限制了其应用,如何获得特异、高效、一定数量的T细胞是目前亟待解决的问题。采用T细胞受体(T cell receptor TCR)基因转染的方法,将特异性高亲和力TCR转移到受体的T细胞中,可以特异性杀伤受体体内的肿瘤细胞。蛋白酶3是与人中性粒细胞颗粒形成相关的分化抗原,髓性白血病患者体内原始低分化的髓系白血病细胞持续高表达蛋白酶3,提示蛋白酶3是髓性白血病相关性抗原。PR1为来自蛋白酶3的HLA-A2限制性的9肽,其序列VLQELNVTV。PR1限制性CTL细胞可杀伤髓性白血病细胞,而且其杀伤毒性与白血病细胞内蛋白酶3的表达量明显相关,但对正常骨髓细胞无毒性。本研究的目的是制备可溶性HLA-A*0201/PR1四聚体,优化PR1肽刺激产生的高亲和力T细胞条件,联合四聚体技术和流式细胞技术筛选PR1特异性高亲和力T细胞,为慢性髓细胞性白血病的过继治疗清除白血病微小残余病变奠定基础。一、可溶性HLA-A*0201/PR1四聚体的制备本室在前期工作中已成功构建重链pQE31-HLA-A2-BSP和轻链pQE31-β2m,二者均可以在M15菌株中大量表达。将诱导、洗涤包涵体获得的重链、轻链蛋白与PR1肽以一定的比例加入折叠缓冲液中进行稀释复性,形成HLA-A*0201/肽复合物单体。用HLA-I构象特异性的W6/32单抗为一抗,间接ELISA法检测复性前后HLA-A*0201/抗原肽单体。然后,将复性后单体经Sephacryl-S300柱层析纯化,利用分子筛原理收集HLA-A*0201/肽复合物单体所在峰。以BirA酶作用于融合在HLA-A*0201蛋白C端BSP中的赖氨酸残基,使HLA-A*0201/肽复合物单体生物素化,再次经Sephacryl-S300柱层析纯化。生物素化的HLA-A*0201/肽复合物单体与荧光素(phycoerythrin或allophycocyanine)标记的链霉亲和素(含4个生物素化位点)按4∶1的比例结合,形成可溶性HLA-A*0201/PR1四聚体。本实验成功地获得了可溶性HLA-A*0201/PR1四聚体,为标记抗原特异性T细胞,进一步筛选研究CML相关的PR1特异性T细胞提供重要工具。二、体外诱生PR1特异性细胞毒性T细胞的研究首先,我们制备加载PR1抗原肽的T2细胞作为刺激细胞,体外刺激人外周血淋巴细胞(PBL),用可溶性HLA-A*0201/PR1四聚体检测PR1特异性细胞毒性T细胞,结果表明HLA-A*0201 /PR1四聚体具有PR1肽表位特异性,可以采用流式细胞分析技术体外分析或分选PR1特异性细胞毒T细胞。然后,用加载不同浓度PR1肽的T2细胞刺激HLA-A*0201阳性的正常人外周血淋巴细胞,进一步优化加载抗原量、刺激时间、刺激细胞与反应细胞比例等。实验发现当PR1肽加载浓度为0.5μmol/L和5μmol/L、刺激时间为21天、刺激细胞与反应细胞比例为1:10时,所获得的PR1特异性高亲和力CTLs比较多。用LDH释放实验对诱生PR1特异性细胞毒T细胞的功能进行初步验证,结果发现经体外诱生PBL特异性杀伤加载PR1肽T2靶细胞的能力明显增强,表明体外诱生的PR1特异性细胞毒T细胞具有特异性细胞毒杀伤能力。本实验为慢性髓细胞性白血病过继性免疫治疗奠定了基础。