伏马菌素(Fumonisins)是以串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)和再育镰刀菌(F.proliferatum)为主的致病菌产生的真菌毒素,严重污染玉米、高粱、水稻等多种粮食作物及其产品。伏马菌素可引起人、畜中毒,具有潜在的致癌性,其中伏马菌素B1(FB1)已被国际癌症研究机构认定为2B类致癌物。FDA和欧盟对食品和饲料中该毒素量规定严格的控制标准。因此,发展伏马菌素的快速、准确的检测技术,分析我国主要镰刀菌的产毒类型,对于保障食品安全和人、畜健康具有重要意义。黄曲霉菌(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)产生的黄曲霉毒素,具有强烈的致癌和致畸作用,已被国际癌症研究中心认定为I类致癌物。在我国黄曲霉菌是形成黄曲霉毒素的主要真菌。黄曲霉菌特异抗体既可用于免疫检测产毒菌,也可用于防治或消除黄曲霉菌及其毒素。因此,表达、分析基于我国代表性黄曲霉菌菌株筛选的特异抗体,将为进一步有效利用这些抗体提供资料。本实验围绕伏马菌素免疫及化学检测和黄曲霉菌特异抗体表达开展了研究,取得的主要结果如下:1.以镰刀菌种群特异引物分子鉴定分离的温暖镰刀菌(F.temperatum)、胶孢镰刀菌(F.subglutinans)和串珠镰刀菌(F.verticillioides)的菌种类型,同时以毒素合成关键基因为靶位点,对3种镰刀菌的产毒类型进行了分子检测。结果表明,串珠镰刀菌具有伏马菌素的产毒基因,而温暖镰刀菌和胶孢镰刀菌没有该基因。2.在玉米培养基中接种3种不同类型的镰刀菌,用于检测菌株的产毒类型和产毒量。利用液相色谱质谱联用仪(LC-MS/MS)对毒素进行化学检测,结果表明串珠镰刀菌可以产生伏马菌素,而温暖镰刀菌和胶孢镰刀菌不能产生。此外,利用酶联免疫法(ELISA)对毒素进行免疫学检测,结果与化学检测一致,同时这两项检测结果与分子检测具有很好的一致性。结合分子检测、化学检测及免疫学检测结果,表明在这3种类型的镰刀菌中,只有串珠镰刀菌是伏马菌素的产生菌。3.将两个对黄曲霉菌细胞壁蛋白亲和力较强的单链抗体(sc Fv3和sc Fv12),通过3中不同的连接短肽(218linker,G4S,(G4S)3)构建二聚体抗体,并进行原核生物过量表达和亲和层析纯化。SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,三种二聚体抗体均可在原核表达体系中表达,为大量制备抗体用于黄曲霉菌检测分析打下了基础。4.利用抗菌肽(MSI99和AFP2)和抗黄曲霉细胞壁蛋白单链抗体(sc Fv3和sc Fv12)构建了8种不同组合的植物表达载体,其中包括以抗菌肽或单链抗体单独构建的载体以及抗菌肽-单链抗体融合基因的载体。通过农杆菌介导法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),成功获得转基因阳性植株,通过温室加代及各世代分子鉴定,已培养至T3代。5.利用半定量PCR方法对转基因拟南芥T3代阳性植株进行转录水平的鉴定,结果表明,抗菌肽、单链抗体及其抗菌肽-单链抗体融合基因在T3代植株中均可被转录。还探索了拟南芥离体叶片接种黄曲霉菌孢子的方法,发现黄曲霉孢子可以侵染拟南芥叶片,但不能扩展。