目的IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)为一免疫病理学诊断名称,肾活检免疫病理结果为肾小球系膜区以IgA颗粒样沉积为主,临床上以血尿、蛋白尿为主要表现的肾小球肾炎。某些系统性疾病,如过敏性紫癜、肝硬化等也可导致肾小球系膜区IgA为主的免疫球蛋白沉积,但还没有系统研究可以证实结核杆菌感染是否能够导致肾小球系膜区有IgA为主的免疫球蛋白沉积。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)对肾脏的损伤分为临床肾结核、病理肾结核、结核性变态反应综合征和/或结核性自身免疫性疾病肾损伤。但由于尿培养MTB需要4周,结核菌向尿中排放成间歇性,菌阴结核占结核总数的70%,所以MTB相关肾脏损伤早期诊断与防治均尚十分薄弱。本试验目的是进一步明确肾组织上表达结核分枝杆菌Ag85(Mycobacteriumtuberculosis Ag85,MTB-Ag85)在结核杆菌感染致早期肾损伤诊断中的意义,并在已证实有结核杆菌感染患者肾活检组织中,检测MTB-Ag85和IgA1,探讨二者表达的相关性。材料和方法一、实验材料1、实验标本及分组本研究所选各组病例均来自2005年至2007年在中国医科大学附属第一医院住院患者,平均年龄为42.5±19.5岁。(1)阳性对照组:泌尿外科住院的临床肾结核患者外科手术切除肾组织石蜡切片,及其术前24小时尿沉渣,其中6名男患、4名女患,共10例。(2)阴性对照组:肾内科住院的无结核病史及活动结核灶、PPD或血结核抗体检验均为阴性,临床确诊为非IgAN的原发性肾小球肾炎患者肾组织石蜡切片,及其24小时尿沉渣,其中6名男患、6名女患,共12例。(3)实验组:肾内科住院的具有结核病史或活动结核灶、PPD2+或血结核抗体两次阳性、尿培养或尿沉渣查抗酸杆菌阳性肾病患者的肾活检组织石蜡切片,及其24小时尿沉渣,其中20名男患、22名女患,共42例。2、主要试剂和药品抗结核分枝杆菌抗原85(Anti Mycobacterium tuberculosis Ag85,MTB-Ag85)、荧光黄标记抗人免疫球蛋白A1(Anti-Human IgA1-FITC)、免疫组化SABC即用试剂盒、DAB显色试剂盒、生物素化羊抗小鼠IgG1。3、主要仪器37℃孵育箱、微波炉、烤片机、光学显微镜、荧光显微镜、显微照相仪、显微图像分析仪、分光光度计。二、实验方法1、尿培养结核分枝杆菌收集各组患者24小时尿液,去上清,留20ml沉渣,离心沉淀后,将沉渣加入4%氢氧化钠溶液消化,无菌操作取上清液,离心后取管底沉渣,加入6%硫酸混匀,将此标本全部接种与固体罗氏培养基斜面,置37℃温箱培养,每周定时观察生长情况,如经过2个月培养后仍无细菌生长为阴性结果。若有细菌生长,如生长慢,培养基呈干燥、颗粒状乳酪色菌落,涂片染色抗酸性强,呈单个散在或索状排列或成簇成团的杆菌,则为有结核杆菌生长。2、肾组织形态学检查肾组织标本用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,HE常规染色,普通光学显微镜观察。3、免疫组织化学结果分析SABC法进行免疫组织化学染色,DAB显色。显微照相仪照相,显微图像分析仪对图像定量分析。每张切片随机选取5个高倍视野(400倍),测定其阳性染色物质分光密度(Intergrate optical density,IOD)值。4、免疫荧光结果分析直接荧光免疫法检测各组标本中的IgA1。荧光显微照相仪照相,显微图像分析仪对图像定量分析。每张切片随机选取5个高倍视野(400倍),测定其阳性染色物质平均灰度值。5、临床资料分析PPD、与血结核抗体检测。6、统计分析方法计量资料x~2检验分析各组相关性,SPSS13.0统计分析软件分析处理数据,P≤0.05有统计学意义。结果1、尿培养查结核分枝杆菌阳性对照组10例患者尿中3例结核分枝杆菌阳性。阴性对照组患者尿中结核分枝杆菌培养均阴性。实验组42例患者尿中7例结核分枝杆菌阳性。2、肾组织病理检测(1)实验组肾活检病理诊断结果实验组42例,经我院中心实验室会诊诊断其中有26例为IgAN,8例为非IgA轻中度系膜增生性肾小球肾炎,4例为硬化性肾小球肾炎,2例为轻微病变型肾小球肾炎,2例为膜性肾病。(2)免疫组织化学检测MTB-Ag85结果阳性对照组肾组织中MTB-Ag85均为阳性,可见褐色颗粒状阳性物质沉积在肾间质、肾小管细胞的胞浆及肾小球系膜区、毛细血管基底膜。阴性对照组肾组织中1例可见浅褐色物质片状分布于组织边缘部分肾间质。实验组肾组织中27例可见褐色颗粒状阳性物质沉积在肾间质、肾小管细胞的胞浆及部分肾小球系膜区、毛细血管基底膜。肾脏病理损伤严重部位阳性物质沉积亦较多。阳性对照组与实验组IOD值分别为(36.54±10.06)×10~3和(33.69±11.82)×10~3,两者比较差异无统计学意义(P＞0.05)。(3)免疫荧光检测IgA1结果阳性对照组均见肾小球系膜区、毛细血管袢及部分肾小管上皮细胞内可见黄绿色阳性物质颗粒样沉积。阴性对照组肾组织中IgA1表达均阴性。实验组肾组织切片中,35例肾组织上检测到IgA1,其中免疫荧光诊为IgAN的26例、非IgA系膜增生肾小球肾炎8例、硬化性肾小球肾炎1例,黄绿色阳性物质颗粒样物质主要沉积于肾小球系膜区、毛细血管袢及部分肾小管细胞胞浆内;7例肾组织上未检测到IgA1,其中病理类型为硬化性肾小球肾炎3例、轻微病变型肾小球肾炎2例和膜性肾病2例。阳性对照组、阴性对照组和实验组的灰度测定分别为(59.83±4.16)、(10.02±1.38)和(57.94±4.08),阳性对照组与实验组的平均灰度值比较无统计学差异(P＞0.05);阴性对照组与阳性对照组或实验组的平均灰度值比较均有统计学差异(P＜0.05)。3、实验组尿培养MTB、PPD检测、血结核抗体检测三种常用结核诊断方法与MTB-Ag85检测结果的相关性分析实验组MTB-Ag85的阳性表达与尿培养结果之间在统计学上有关联性(P~*＜0.005),其关联系数C值为0.548;与PPD检测结果之间在统计学上有关联性(P~#＜0.05),其关联系数C值为0.323;与血结核抗体检测结果之间在统计学上有关联性(P~△＜0.05),其关联系数C值为0.298。结论1、肾组织上检测MTB-Ag85可以作为结核感染相关性肾损伤的早期诊断指标之一。2、结核分枝杆菌感染致肾损伤与IgAN发病存在相关性。