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目的(1)探索中国实验小型猪骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)的分离、体外培养扩增,以及鉴定的方法。(2)应用冠脉介入方法建立小型猪急性心肌梗死(AMI)动物模型,并完成自体EPCs的移植,观察对于急性心梗的疗效。(3)应用临床型高场强3.0TMR机和特殊MR序列进行干细胞SPIO标记的体外和活体内的成像研究,动态观察移植干细胞的定位、存活及迁徙。实验方法(1)EPCs体外培养:抽取小型猪骨髓,加入Ficoll淋巴细胞分离液中,以密度梯度离心法分离单个核细胞(EPCs),加入猪重组VEGF和bFGF的EPCs专用培养基培养、传代。对传代细胞采用FACS分别标记抗CD31、CD133、Flk-1及Ⅷ因子,并采用Western blot法、流式细胞术、激光共聚焦显微镜和透射电镜进行检测鉴定。(2)体外SPIO标记:体外以不同浓度SPIO标记EPCs,观察不同标记浓度的细胞标记率及对细胞生长的影响,明确孵育时间和适当的标记浓度,以及标记持续时间和对MR成像效果的影响。(3)建立急性心肌梗死动物模型:选用27只中国实验小型猪(30-35kg,雌雄不限)通过介入手术,将小型猪冠状动脉左前降支LAD第二对角支下方球囊封堵90分钟后恢复血流的方法建立AMI模型,术中心电图动态检测,并于术前及术中用心脏二维超声检查动态观测梗死区大小及心功能变化。(4)自体EPCs经冠状动脉介入移植:选用造模成功的15只小型猪,随机分为3组,对照组(A组,n=3)、EPCs治疗组(B1组,n=6;B2组,n=6),其中治疗组(B1组于造模后1h、B2组于造模完成2w后)将体外培养扩增的经SPIO标记的自体EPCs经冠状动脉介入梗死区供血动脉。(5)临床型高场强3.0TMR机和特殊MR序列的首次应用:在临床型高场强3.0TMR机上首次运用针对细胞水肿(T2-weighted TrueFISP Imaging of Myocardium)和对Fe离子特殊显影(CV-3DRAD-400C)的MR序列(由西门子公司科研部提供),将对急性心梗及含Fe干细胞的MR成像有特异性显影。对照组(A组)于造模术后当天、1W、2W、3W、4W分别行3T磁共振扫描,治疗组于造模术后当天、EPCs移植术后当天、1W、2W、3W、4W分别行3T磁共振扫描。同时用超声心动图分别在移植前、后测定左心功能。对3组结果进行比较分析,动态观察梗死区大小及心功能变化,以及移植细胞的定位、存活及迁徙。同时与超声心动图结果做对比,对比评价细胞移植的疗效。(6)生化指标检测:于球囊封堵前、球囊封堵后30min、1h、2h、4h分别经耳静脉取血,动态观测急性心梗血清心肌酶谱及肌钙蛋白的变化。对比功能性指标(心电图)、生化指标(血清心肌酶谱和肌钙蛋白I)及影像学指标(3T磁共振扫描和心脏二维超声检查)的变化,对结果进行比较分析。(7)组织病理检测:经组织学检查验证标记细胞在心肌内的存活及迁徙。实验结果(1)经多种方法检测,从形态、表达和功能上鉴定骨髓来源的,经诱导后获得的细胞是EPCs细胞。透射电镜观察到典型的Weibel-Palade小体。Western blot显示细胞表面的Flk-1蛋白在14d时表达最高。流式细胞术检测结果为CD31、CD133、Flk-1的表达分别为83.86%、85.34%、83.52%。激光共聚焦显微镜显示CD31、CD133、Flk-1的荧光标记率大约在95%~98%。细胞吞噬DiI-acLDL后荧光显色率大约在88%~92%。(2)SPIO体外标记EPCs的理想标记浓度约在20～50μgFe/ml左右,超过50μg Fe/ml培养液浓度可使细胞的生物学活性受影响。二者共同孵育24h后的标记率在95%以上,体外标记成像可以持续4周以上。(3)26只中国实验小型猪术中发生室颤及术后心力衰竭死亡11只,造模成功15只。治疗组移植细胞前、后对小型猪梗死心肌的超声心动图检查证实,EPCs移植4w后心脏功能有一定恢复,与心梗后即刻相比,左室收缩期室壁增厚率显著提高(P<0.05),左室壁运动幅度增加,左室射血分数提高。并且B1组较B2组效果明显,但二组间差异无统计学意义(P>0.05)。(4)MR扫描可以显示EPCs的自体移植可以有效地促进心脏功能恢复,缩小心肌梗死区域。针对心肌急性水肿(T2-weighted TrueFISP Imaging of Myocardium)的MR序列对早期AMI形态、大小显影清晰,对于急性水肿敏感,图像质量明显优于常规MR心脏序列。Fe离子特殊显影(CV-3DRAD-400C)的MR序列可以清晰显示SPIO标记的EPCs在梗死区的形态、大小、位置的变化。(5)球囊封堵左前降支LAD远端后,心电图即刻就出现ST段持续性抬高,显示急性心肌梗死典型图形变化。血清心肌酶谱及肌钙蛋白的变化呈动态演变,球囊封堵后30min变化不明显,1h后略升高,至4h时才出现明显升高。心脏二维超声检查实时、便捷,它于球囊封堵后10min开始出现内膜回声细点状增强,随时间延长,内膜回声逐渐增强、增厚,封堵后90min,心肌内可见点状回声,心肌三层结构不清晰。MR影像对判断心肌的异常梗死早于生化指标检测,且相比较超声图像更清晰、稳定,不受人为因素干扰。(6)组织学检查证实EPCs的自体移植可以有效地促进心脏功能恢复,缩小心肌梗死区域,促进梗死区新血管形成。结论(1)联合采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法易于分离、纯化获得纯度较高的EPCs。选择24h未贴壁细胞进行诱导分化可以获得纯度、成熟度较高,细胞功能较好的EPCs细胞。(2)SPIO可以对移植的EPCs进行有效的标记。(3)应用临床型高场强3TMR机和特殊MR序列可以清晰显示梗死心肌及及SPIO标记的EPCs活体示踪,动态观察移植干细胞的定位、存活及迁徙,评价EPCs的移植效果。(4)EPCs自体移植可以促进梗死区新血管形成,有效地缩小心肌梗死区域,改善心功能和预后。