背景与目的原发性肝癌(hepatocellular cancer,HCC)是人类发病率较高的恶性肿瘤之一,致死率在所有恶性肿瘤中排名第三,目前已成为严重的世界性公共卫生问题。在中国特别是在经济落后的地区,肝癌的死亡率很高。复发转移是肝癌生物学特性的集中体现,也是肝癌高死亡率的最主要原因。据报道60%的肝癌患者在就诊的时候已经发生了转移,肝癌发生转移患者的5年生存率明显低于无转移的患者。虽然精准肝切除术已广泛的应用于临床,加之放疗和介入化疗等多种方法用于术后的综合治疗,肝癌的治疗效果取得了较大的改善,但是肝癌术后的高转移及复发率,使得肝癌治疗的整体预后仍不尽如人意。因此从分子层面研究肝癌转移的机制,对于肝癌的治疗意义重大。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮细胞转化为间质细胞的生理过程,细胞一方面丧失了极性,另一方面细胞之间的粘附能力下降,并且使细胞获得迁移和侵袭的能力,最终转变为具备间质细胞形态和移行能力的细胞。EMT参与了许多生理和病理过程,并且发挥了重要作用,这其中包括:器官的发育、胚胎的发育、损伤组织的修复、器官纤维化过程和肿瘤侵袭转移等。上皮来源的恶性肿瘤首先通过发生EMT使肿瘤获得迁移和侵袭的能力,然后通过血液转移到机体不同部位,最后形成转移瘤。EMT的发生机制在众多实体肿瘤中进行了深入的研究,包括肝癌。然而肝癌治疗需要对EMT发生的调控机制进行深入的研究。T细胞免疫球蛋白及黏蛋白分子3(Tim-3)是TIM基因家族的重要成员之一,被认为参与了多种类型癌的进展,包括肝细胞癌(HCC);在肝癌的进展中,Tim-3被认为是一种新的参与者,并且调节着肝癌的生物学行为。Tim-3在肿瘤免疫中被认为是一种负性免疫调节分子,发挥重要作用,参与着多种病理及生理过程的免疫调节。有报道Tim-3参与了宫颈癌、肝癌、结肠癌等肿瘤的T细胞免疫调节,在肿瘤细胞体外培养中的研究发现Tim-3能够抑制自体CD8+T细胞的增殖的速度。在骨肉瘤的研究中,Tim-3参与了骨肉瘤的发生和发展过程而且诱导的肿瘤细胞获得了EMT的特点。然而,据我们所知,目前还有没研究阐述Tim-3与肝癌EMT的关系。本文旨在探讨Tim-3在肝癌转移中的作用机制和Tim-3与肝癌细胞发生上皮间质转化的关系。有研究发现肝癌细胞发生上皮间质转化是肝癌转移关键步骤,肝癌细胞发生EMT的相关标志物为:E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、Twistl、Slug、Snail、Smad。该研究通过转染Tim-3过表达质粒和转染Tim-3siRNA干扰Tim-3的表达,构建Tim-3高低表达细胞模型,改变Tim-3的表达水平,然后应用Real-timePCR和 Western blot 检测 EMT 相关标志物 E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、Twistl、Slug、Snail、Smad的表达,并检测肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化。通过该研究阐述了 Tim-3在肝癌转移中的重要作用和Tim-3与肝癌细胞发生EMT的关系。提示Tim-3可能诱导了 EMT的发生从而促进了肝癌的转移,通过干扰Tim-3的表达有望成为阻滞肝癌EMT发生和治疗肝癌转移的有效干预手段。材料与方法第一部分Tim-3在肝癌细胞中低表达和过表达细胞模型的建立目的:探讨Tim-3在肝癌转移中的作用,检测Tim-3在肝癌细胞及正常肝细胞的表达情况,构建Tim-3高表达及低表达细胞模型,并检验模型是否建立成功。方法:1、培养人类肝癌细胞SMMC-7721、正常人肝细胞L02。2、荧光实时定量 PCR(Real-time fluorescent polymerase chain reaction,Real-timePCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测肝癌细胞SMMC-7721、正常人肝细胞L02中Tim-3 mRNA和蛋白的表达。3、通过脂质体瞬时转染的方法将PEX-3-hTim-3过表达质粒及Tim-3siRNA转染人肝癌细胞SMMC-7721,转染成功后建立了肝癌细胞Tim-3的高表达和低表达细胞模型。4、转染后24小时,通过倒置荧光显微镜观察,转染成功的肝癌细胞表达GFP,镜下可显示绿色荧光。运用Image-Pro Plus图像分析处理软件,进行图像采集、分析。同时转24小时后通过Real-time PCR检测Tim-3 mRNA表达;72小时通过Western blot检测Tim-3蛋白表达来鉴定模型。结果:1、与正常人肝细胞LO2相比肝癌细胞MMC-7721高表达Tim-3,提示Tim-3可能与肝癌细胞侵袭转移有关。2、荧光显微镜观察两组转染细胞,两组细胞均可见绿色荧光,统计分析转染siRNA和过表达质粒PEX-3-hTim-3转染效率分别为81.25%和 83.36%。3、RT-PCR和Western blot结果提示转染PEX-3-hTim-3高表达质粒的肝癌细胞组,Tim-3的表达明显高于对照组和转染空质粒pEX-3组。转染Tim-3 siRNA,Tim-3的表达较对照组和转染siRNA-NC组明显减低。结论:Tim-3在肝癌细胞和正常肝细胞均有表达,肝癌细胞MMC-7721 Tim-3的表达高于正常人肝细胞LO2,P<0.05,有统计学意义;通过转染成功建立肝癌细胞高表达Tim-3和低表达Tim-3细胞模型。第二部分Tim-3对肝癌细胞转移侵袭能力的影响及其机制的研究目的:应用建立的高表达和低表达Tim-3肝癌细胞模型研究Tim-3对肝癌细胞转移侵袭能力的影响,探讨Tim-3影响肝癌转移侵袭性的可能机制。方法:1、实验分三组:对照组:未接受转染的肝癌细胞SMMC-7721;实验组:转染Tim-3 siRNA,低表达Tim-3的肝癌细胞;阳性对照组:转染PEX-3-hTim-3过表达质粒,转染后癌细胞高表达Tim-3。2、三组肝癌细胞培养72小时后,在倒置荧光显微镜下观察三组细胞镜下特点。3、通过MTT法检测三组肝癌细胞增殖能力变化。4.Transwell小室侵袭实验、细胞划痕损伤愈合实验检验三组肝癌细胞迁移和侵袭能力。揭示Tim-3对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。5、RT-PCR检测不同分组肝癌细胞Tim-3及EMT相关基因:E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、Twistl、Slug、Snail、Smad,mRNA 的表达,同时通过 Western blot 检测 E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、Twistl、Slug、Snail、Smad蛋白表达,每个实验重复三次。6、分析Tim-3表达与EMT相关基因表达的相关性。7、统计分析:数据以平均数标准差表示,并用SPSS 16.0对数据进行分析,P<0.05被认为有统计学上的显著差异。结果:1、SMMC-7721细胞转染72小时后,通过倒置荧光显微镜对三组的细胞形态观察,与实验组相比较,阳性对照组细胞形态多发为纺锤形态,细胞之间形态和连接较少,表现为更强的迁移和侵袭性,同时实验组上皮细胞多触角凸起,表现为更强的紧密接触和粘附性,表现出低的迁移和侵袭性。2、MTT检测三组肝癌细胞细胞增值率,在前12小时细胞增值率没有显著差异,12小时后三组细胞增值率出现显著差异,在观察的72小时内,随着时间延长,差异越来越明显。培养72小时,实验组与对照组相比较,肝癌细胞增殖能力明显下降,实验组增殖能力是对照组的71.71%(F=145.758，P<0.05)阳性对照组细胞增殖能力明显高于对照组和实验组,是对照组的260.12%,有显著性差异(F=195.428,P<0.05)。3.Transwell迁移实验中:实验组与对照组和阳性对照组相比较,肝癌细胞迁移和侵袭明显减少,设置对照组迁移和侵袭的细胞数为100;实验组迁移和侵袭的相对细胞数分别为:61 ±8和34±7;阳性对照组迁移和侵袭的相对细胞数细胞数分别为:157±10和179±11三组之间比较均有显著性差异(P<0.05),实验说明抑制Tim-3表达肝癌细胞迁移和侵袭力明显下降。故Tim-3表达水平的改变,影响肝癌的迁移和侵袭性。细胞划痕实验72小时后三组细胞均向划痕中间迁移,阳性对照组肝癌细胞几乎将中间划痕铺满,对照组划痕部位仍有一定间隙,实验组肝癌细胞少量向划痕中间迁移,实验组伤口愈合率较阳性对照组差异有统计学意义(F=168.365,P<0.05)。4、RT-PCR结果显示,阳性对照组E-cadherin的表达较对照组明显下降,差异有统计学意义(F=2830,P<0.05),而N-cadherin、MMP-9、Twistl、Snail、Slug、Smad的表达量较对照组明显升高,差异均有有统计学意义(P<0.05)。实验组降低了 Tim-3的表达,E-cadherin的表达较对照组明显上升,与对照组相比较,差异有统计学意义,(F=2932,P<0.05),同时 N-cadherin、MMP-9、Twistl、Snail、Slug、Smad的表达量较对照组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),Western blot实验结果同PCR结果一致,同样表明抑制Tim-3表达,可阻止肝癌EMT的发生。5、Tim-3的表达与E-cadherin的表达成负相关(r=-0.870,P=0.00<0.05),Tim-3 表达-与 N-cadherin、MMP-9、Twistl、Snail、Slug、Smad均呈现正相关,具有统计学意义(P<0.05)结论:1、三组细胞培养72小时镜下观察细胞形态,实验组细胞上皮细胞多触角凸起,表现为更强的紧密接触和粘附性呈现出低侵袭和转移性。阳性对照组细胞为纺锤形态,细胞之间形态和连接较少,表现为更强的迁移和侵袭性。阳性对照中肝癌细胞获得EMT的特点。2、通过MTT法检测三组细胞的增殖率,阳性对照组在细胞培养12小时后,细胞增殖率高于实验组和对照组,提示Tim-3表达可能影响肝癌细胞的增殖。3、Transwell小室迁移实验和细胞划痕实验检验三组细胞的迁移及侵袭性,结果提示高表达Tim-3的阳性对照组细胞表现较强的迁移及侵袭性,而实验组抑制Tim-3的表达,细胞的迁移及侵袭性明显降低,两组有统计学差异(P<0.05),提示Tim-3促进了肝癌细胞的迁移及侵袭。4、Real-time PCR 和 Western bolt 检测 EMT 相关标志物:E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、Twistl、Snail、Slug、Smad 的表达。结果提示:阳性对照组中上皮标记物E-cadherin的表达下降,而间质标记物:N-cadherin、MMP-9、Twistl、Snail、Slug、Smad 的表达上升,从而提示肝癌细胞发生了上皮间质转化;实验组抑制Tim-3的表达,E-cadherin的表达明显上升,而间质标记物:N-cadherin、MMP-9、Twistl、Snail、Slug、Smad的表达下降,肝癌细胞的上皮间质转化受到抑制,提示Tim-3促进肝癌细胞发生EMT,导致迁移和侵袭能力增大,这与MTT实验、细胞划痕实验、Transwell结果一致。5、Tim-3的表达与EMT相标记物表达做相关性分析显示,Tim-3的表达与E-cadherin的表达成负相关,与N-cadherin、MMP-9、Twistl、Snail、Slug、Smad的表达成正相关。提示Tim-3诱导了肝癌细胞EMT的发生,从而影响肝癌细胞的迁移、侵袭、增殖。