目的:　　1、通过统计分析2009-2012年四年来肠杆菌科细菌对常用抗生素的耐药情况，为临床合理使用抗生素提供数据上的借鉴，并筛选出120株碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌(Carbapenems-resistant Enterobacteriaceae，CRE)以供后期研究。　　2、了解120株CRE菌株的同源性分布情况，以便更系统全面的对同源株及非同源株进行耐药基因的检测研究。　　3、研究本地区临床分离的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的耐药基因，以确定本地区碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶、产ESBLs、AmpC酶的主要基因型别以及膜孔蛋白缺失的情况。综合分析同源株与非同源株之间耐药机制的不同，最终来指导临床合理使用抗生素。　　方法:　　1、采用WHONET5.4软件对2009-2012年肠杆菌科细菌（肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌、粘质沙雷菌、枸橼酸杆菌和阴沟肠杆菌）的药敏情况进行统计分析。　　2、药物敏感性试验:参照美国临床和实验室标准化协会(Clinical andLaboratory Standards Institute，CLSI)推荐方法，采用K-B纸片法测定细菌碳青霉烯类药敏纸片的抑菌圈直径，从而筛选并确认耐碳青霉烯类菌株;采用琼脂稀释法测定抗生素（包括亚胺培南、美洛培南、厄他培南、头孢吡肟、替加环素）对细菌的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentrations，MIC)　　3、同源性分析采用肠杆菌科基因间重复一致保守序列PCR方法(Enterbacterial repetitive intergenic consensus，ERIC-PCR)扩增提取DNA后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带的情况分析菌株是否具有同源性。　　4、改良Hodge试验参照CLSI标准进行，采用改良Hodge试验初步判断菌株是否产碳青霉烯酶。　　5、用聚合酶链反应(PCR)和DNA序列分析对120株碳青霉烯类耐药株进行基因检测，包括blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaNDM-1、blaOXA、blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaDHA、blaLAT-1、blaMIR以及膜孔蛋白OmpC、OmpF。　　6、随机选取10株阳性扩增菌株的质粒提取物与叠氮钠耐受的敏感态大肠埃希菌J53(E.coli.J53)进行电转化，并对电转化后的菌株进行目标基因的PCR扩增及碳青霉烯类抗生素MIC值的检测。　　结果:　　1、药敏结果统计:2009年、2010年、2011年、2012年收集到肺炎克雷伯菌1445株、大肠杆菌3600株、奇异变形杆菌442株、产气肠杆菌332株、粘质沙雷菌157株、枸橼酸杆菌109株、阴沟肠杆菌468株。四年来抗生素耐药率的总体情况如下:氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦相对比较高，分别为80％、50％左右;其次是头孢类抗生素中头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟，耐药率在30-90％之间不等;喹诺酮类的耐药率在25-55％之间;耐药率较低的是阿米卡星和碳青霉烯类，分别为0-17％和0-10％之间。　　2、2009-2012年共分离到耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌共计120株，包括肺炎克雷伯菌30株、大肠埃希菌20株、变形杆菌20株、产气肠杆菌10株、粘质沙雷菌20株、枸橼酸杆菌10株、阴沟肠杆菌10株;菌株主要来源于本院不同病区，包括ICU(44.2％)占第一位、其次是呼吸内科(18％)、血液科(7.5％)、肿瘤科(6.7％)、肝胆外科(5.8％)、其他科室(17.8％);标本主要包括痰液、尿液、脓液、血液、胆汁等。120株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌对6种常用抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)，头孢吡肟MIC值≥128 g/ml的菌株占89.1％(107/120)，MIC50≥128 g/ml;厄他培南MIC值≥128 g/ml的菌株占34.2％(41/120)，MIC50=32 g/ml;美罗培南MIC值≥128 g/ml的菌株占30.8％(37/120)，MIC50=64 g/ml;亚胺培南MIC值≥128 g/ml的菌株占28.3％(34/120)，MIC50=64 g/ml;阿米卡星MIC值≥32 g/ml的菌株占44.2％(53/120)，MIC50=16 g/ml;替加环素MIC值≥8 g/ml的菌株占14％(14/100)，MIC50=2 g/ml;奇异变形杆菌对替加环素天然耐药本研究未测。　　3、同源性分析结果　　30株碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌共发现6种基因型。A型，19株（编号:1，2，4-13，15，21，22，26，27，28，30）;B型，5株(编号:14，17，19，20，23);C型，3株（编号:18，25，29）;D型，1株（编号:3）;E型，1株（编号:16）;F型，1株（编号:24）。不同的基因型分别分布在不同的病区，A和B基因型主要集中在ICU病区，C型主要在呼吸内科。　　20株大肠埃希菌共发现6种基因型。A型，2株（编号:1，17）;B型，8株（编号:2，4，5，8，16，18-20）;C型，3株（编号:3，10，14）;D型，3株（编号:6，7，11）;E型，3株（编号:9，12，13）;F型，1株（编号:15）。不同的基因型分别分布在不同的病区，B基因型主要集中在ICU病区，C型主要在呼吸内科，E型主要在肿瘤科。　　20株奇异变形杆菌共发现6种基因型。A型，6株(编号:1，8，9，11，16，19);B型，3株（编号:2，10，11）;C型，4株（编号:3，13，14，17）;D型，2株（编号:4，18）;E型，4株（编号:5，6，15，20）;F型，1株（编号:7）。不同的基因型分别分布在不同的病区，A和B基因型主要集中在ICU病区。　　10株产气肠杆菌共发现5个基因型。A型，1株（编号:1）;B型，1株（编号:2）;C型，4株（编号:3，6，8，9）;D型，3株（编号:4，7，10）;E型，1株（编号:5）。不同的基因型分别分布在不同的病区，C基因型主要集中在呼吸内科，D型主要集中在ICU病区。　　20株粘质沙雷菌共发现5个基因型。A型，4株（编号:1，8，15，20）;B型，2株（编号:2，9）;C型，4株（编号:3，4，11，17）;D型，6株(编号:5，6，12，13，16，19);E型，4株（编号:7，10，14，18）。不同的基因型分别分布在不同的病区，A、C、D基因型主要分布在ICU病区，B型主要分布在肝胆外科。　　10株枸橼酸杆菌共发现5个基因型。A型，2株（编号:1，4）;B型，2株（编号:2，7）;C型，3株（编号:3，6，8）;D型，2株（编号:5，9）;E型，1株（编号:10）。不同的基因型分别分布在不同的病区，B型主要分布在ICU病区，C型主要分布在呼吸科。　　10株阴沟肠杆菌共发现4个基因型。A型，4株（编号:1，2，6，7）;B型，3株（编号:3，8，10）;C型，1株（编号:4）;D型，2株（编号:5，9）。不同的基因型分别分布在不同的病区，A型主要分布在ICU病区，B型主要分布在呼吸科。　　4、改良Hodge试验结果显示120株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌中阳性116株。　　5、120株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的PCR及DNA基因测序检测结果:碳青霉烯酶:blaKPC阳性116株，占96.7％; blaOXA阳性4株，占3.3％;ESBLs: blaCTX-M阳性90株，占75％; blaTEM阳性7株，占5.8％; blaSHV阳性7株，占5.8％;　　AmpC酶:blaLAT-1型32株，占26.7％，blaDHA型26株，占21.7％，blaMIR型11株，占9.1％;　　膜孔蛋白缺失:单纯膜孔蛋白OmpC缺失的有13株，占10.8％，单纯膜孔蛋白OmpF缺失的有13株，占10.8％，膜孔蛋白OmpC和OmpF同时缺失的有9株，占7.5％。　　6、随机选取10株KPC基因PCR扩增阳性的菌株，提取其质粒，然后将提取物经电转化大肠埃希菌J53，使转化子大肠埃希菌J53对亚胺培南、美洛培南和厄他培南的MIC值增高2-64倍，PCR扩增转化子大肠埃希菌J53blaKPC基因均阳性。　　结论:　　1、本地区四年来分离到的肠杆菌科细菌以大肠埃希菌最多，占54.9％　　(3600/6553)，其次为肺炎克雷伯菌，占22.1％(1445/6553)，二者合计占77％(5045/6553)。耐药数据显示，本地区分离的肠杆菌科细菌对氨苄西林/舒巴坦耐药率最高，其次是头孢类抗生素中头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟及喹诺酮类的环丙沙星及左氧氟沙星;耐药率最低的药物为氨基糖苷类中的阿米卡星和碳青霉烯类的亚胺培南、美洛培南和厄他培南。不同菌株对抗菌药物的耐药性存在有较大差异，对常规药物的耐药率，肺炎克雷伯菌＞粘质沙雷菌＞阴沟肠杆菌＞产气肠杆菌＞枸橼酸杆菌＞大肠埃希菌＞奇异变形杆菌;对碳青霉烯类药物耐药率，粘质沙雷菌＞肺炎克雷伯菌＞产气肠杆菌＞枸橼酸杆菌＞阴沟肠杆菌＞奇异变形杆菌＞大肠埃希菌，且有逐年增高的趋势;ESBLs检出率，大肠埃希菌＞肺炎克雷伯菌。　　2、对本地区临床分离的120株碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的同源性分析提示，本地区存在有克隆传播的现象，其传播主要集中在ICU病区。不同菌株间或同一种菌株不同基因型别间对IMP、MEM、ETP、FEP、AK和TGC6种抗菌药物的MIC值存在较大差异，而同一基因型其MIC值一致性非常高。由此建议，医院管理部门和临床要密切关注CRE的检测动态，防止医院内感染的进一步流行和暴发，同时临床应严格执行医院消毒制度。　　3、对本地区临床分离的120株碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的耐药基因研究提示，本地区产KPC型碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药的主要耐药机制，占96.7％，其次产各型ESBLs和AmpC酶，以及膜孔蛋白缺失等因素也更增强了肠杆菌科细菌对碳青霉烯类的耐药水平。建议在日常工作中加强对多重耐药细菌的控制和监测，临床治疗亦应在药敏试验的基础上，针对不同的产酶株合理选择抗菌药物。