目的:糖调节蛋白GRP78在肿瘤的发生发展中具有重要意义,本文通过在Huh7、Hep1-SK肝癌细胞系过表达以及干扰GRP78表达的基础上,探讨GRP78的表达对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。并进一步从GRP78蛋白分子结构基础上探讨GRP78发挥促肝癌细胞增殖、迁移、侵袭功能的分子机制,为进一步研究GRP78作为肝癌药物治疗靶点奠定基础。还制备与鉴定抗GRP78兔多克隆抗体与腹水型鼠单克隆抗体,建立可检测GRP78蛋白的双抗夹心ELISA方法。方法:(1)通过RT-PCR与Western blot分别在mRNA水平与蛋白水平验证Huh7、Hep1-SK肝癌细胞系中课题组前期构建的GRP78重组腺病毒过表达效果以及合成的GRP78干扰RNA的干扰效果。(2)通过长时间动态细胞成像及数据分析系统检测GRP78过表达与干扰之后肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力的影响。(3)通过裸鼠成瘤模型,体内实验验证GRP78过表达后对肿瘤生长的影响。(4)构建GRP78信号肽缺失腺病毒,GRP78蛋白ATP酶结构域ATP38、ATP229、ATP300突变体腺病毒,GRP78蛋白肽结构域R492E、Y570F突变体腺病毒,并通过Western blot分别验证过表达效果。(5)通过长时间动态细胞成像及数据分析系统检测GRP78信号肽缺失,GRP78 ATP酶突变体,GRP78肽结构域突变体对GRP78促肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。(6)制备针对GRP78蛋白的鼠单抗,兔多抗,分别用ELISA、Western blot、IHC检测抗体效价及特异性。用棋盘滴定法建立可检测GRP78蛋白的双抗夹心ELISA免疫学方法。结果:(1)成功在Huh7、Hep1-SK肝癌细胞系中验证了GRP78过表达腺病毒以及GRP78干扰RNA干扰效果。(2)Huh7、Hep1-SK细胞中GRP78过表达后,肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力均明显增强。而Huh7、Hep1-SK细胞转染GRP78 siRNA后,肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力受到抑制。(3)体内实验裸鼠成瘤模型中进一步验证了GRP78过表达后促进肝癌细胞的生长增殖能力。(4)根据GRP78蛋白质空间结构和功能结构域,设计并成功构建了GRP78信号肽缺失腺病毒,GRP78蛋白ATP酶结构域T38A,T229A,S300A突变体腺病毒,GRP78蛋白肽结构域R492E、Y570F突变体腺病毒,并在肝癌细胞系中验证了过表达效果。(5)长时间动态细胞成像及数据分析系统检测GRP78蛋白功能结构突变体中ATP酶结构域突变体ATP229能够抑制GRP78促进肝癌细胞增殖、迁移的作用,而GRP78信号肽缺失,以及其他ATP酶结构域突变体,肽结构域突变体对GRP78的促肿瘤作用没有影响。(6):成功获取了高效价、高灵敏度及高特异性的GRP78兔多抗及腹水型鼠单抗,并在此基础上建立了可检测人GRP78蛋白的双抗体夹心ELISA检测系统。结论:在细胞实验和体内实验均表明,过表达GRP78后肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力增强,而干扰GRP78的表达后,肝癌细胞的增殖、迁移能力减弱,可以得出结论GRP78在促进肝癌细胞的生长中发挥重要作用。同时,进一步从GRP78蛋白功能结构角度探究了GRP78发挥其促肝癌作用的具体功能区域。得出以下结论:GRP78肽结合结构域R492E和Y570F位点突变后对GRP78促肿瘤功能无影响;而GRP78的ATP酶结构域中T38A和S300A位点突变对GRP78促肿瘤功能无影响,只有T229A位点突变后,肝癌细胞的活性明显降低,从而影响其促肿瘤功能。