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苯基乳酸(phenyllactic acid,PLA),是一种天然有机酸,广泛存在于乳酸菌发酵产品和蜂蜜中,因其对细菌和真菌等食源性微生物具有广谱抑制活性,可在食品领域用作新型生物防腐剂而受到越来越多的关注。此外,该物质在制药业、畜牧业和化妆品工业也有重要用途。生物转化合成苯基乳酸包括体外酶转化法、微生物发酵法和全细胞转化法。其中酶转化需要温和的条件且对外界环境不稳定,而发酵法具有生产周期长、底物利用率低和产物分离纯化工艺复杂等缺点。本研究为了获得高产和高光学纯度的D-苯基乳酸,将野生型和突变型D-乳酸脱氢酶基因导入大肠杆菌,同时引入NADH辅因子再生体系,以苯丙酮酸钠为底物,全细胞合成D-苯基乳酸。主要研究成果如下:(1)以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)基因组为模板,经过PCR扩增得到乳酸脱氢酶基因(D-ldh),连接表达载体p ET-28a并导入宿主菌。重组大肠杆菌在1 mmol/L IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测,结果显示在41k D处有显著性蛋白条带,表明该D-乳酸脱氢酶基因在重组大肠杆菌中成功表达。与对照组相比,工程菌乳酸脱氢酶酶活和生物转化能力显著上升,测得乳酸脱氢酶粗酶活为6.3U/mg,苯基乳酸产量达到5.01 g/L,HPLC手性分析显示,D-苯基乳酸光学纯度达到100%。(2)为了提高野生型乳酸脱氢酶对底物的催化活力,将乳酸脱氢酶(LDH)结合位点第52位残基酪氨酸(Tyr)定点突变成亮氨酸(LDHY52L)、丙氨酸(LDHY52A)和缬氨酸(LDHY52V)三种疏水性小氨基酸。在三株突变菌中,与原始菌E.coli p ET-28a-ldh相比,工程菌E.coli p ET-28a-ldhY52V粗酶催化活力和转化能力最高,乳酸脱氢酶酶活提高17.8倍,苯基乳酸产量提高21%。本研究对该工程菌全细胞转化条件进行了优化,最佳的诱导条件为:诱导温度25℃、诱导剂浓度0.2 mmol/L、诱导时间4 h、诱导时机为菌体浓度OD600达到1.2时添加诱导剂。最佳转化条件为:p H7.0,转化温度37℃,底物浓度8 g/L,葡萄糖浓度10 g/L,1%Triton X-100和1 mmol/L Mg2+。在以上最优的条件下通过间断补充底物和葡萄糖进行流加培养,在三个小时内,E.coli p ET-28a-ldh苯基乳酸产量达到12.16 g/L,摩尔转化率为61%。突变菌株E.coli p ET-28a-ldhY52V苯基乳酸产量达到15.56 g/L,摩尔转化率为77%。以上结果表明,利用重组大肠杆菌全细胞转化苯丙酮酸合成苯基乳酸具有现实可行性,乳酸脱氢酶定点突变提高了苯基乳酸的产量和底物转化率。(3)为了进一步提高重组大肠杆菌全细胞转化水平,将来自博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)甲酸脱氢酶基因和大肠杆菌(E.coli)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶分别与乳酸脱氢酶共表达,以强化辅因子再生。单批次全细胞转化结果显示,E.coli p ETDuet-ldhfdh苯基乳酸产量较E.coli p ETDuet-ldh提高13%,而E.coli p ETDuet-ldhzwf不仅没能提高苯基乳酸产量,相反,较E.coli p ETDuet-ldh降低近一半。本文对E.coli p ETDuet-ldhfdh作进一步流加培养。最优的转化条件下,E.coli p ETDuet-ldhfdh苯基乳酸产量为18.15 g/L,生产强度为4.54 g/L/h,摩尔转化率达到94%。本研究D-苯基乳酸产量和转化率不仅达到较高水平,也为重组大肠杆菌生物合成有价值、高光学纯度化合物提供了理论依据。