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中国石竹(Dianthus chinensis)原产中国,是园林绿化中较好的地被材料,但在栽培过程中发现在潮湿温暖环境下,易染石竹叶斑病。几丁质酶是植物受病原菌侵染后诱导产生的,虽然植物本身未发现几丁质,但很多植物病原菌细胞壁的主要成分是几丁质,几丁质酶可抑制一些病原菌孢子萌发和菌丝生长。目前在植物抗病基因工程中,几丁质酶基因的应用效果显著,多种转几丁质酶基因植物的抗病性明显高于对照。本试验试图采用基因工程的方法,初步建立中国石竹的遗传转化体系,并将玉米几丁质酶基因导入石竹,以获得抗病的石竹品种。实验结果如下: 1.建立起以叶片为外植体的高频再生体系 取顶芽下第二三对叶片,以远轴面和培养基接触的方式在MS1(MS+0.1mg/LBA+1.0mg/L2,4-D)中预培养3d后,转入MS2(MS+1.0mg/LBA+0.3mg/LNAA)中分化培养,获得了68.3%的再生频率。 2.建立了以叶片为受体的遗传转化体系 川pBI121/LBA4404对影响石竹转化效率的因素进行比较试验,确定的转化条件为:切取转化受体材料在MS1中预培养3~4d。将二次活化至OD600=0.5的菌液离心,重悬于相同体积添加100μ mol/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中,将预培养叶片放入其中,侵染6~8min,灭菌滤纸吸干,放入添加100μ mol/L乙酰丁香酮的水中共培养(滤纸为基质),暗培养3~4d。共培养结束后,将叶片在附加500mg/LCef的1/2MS液体培养基中轻轻振荡洗涤10min,灭菌滤纸吸干,转入MS2+50mg/LKm+400mg/LCef中进行筛选分化培养,出芽后转入MS6(MS+0.5mgmBA+0.3mg/LNAA+50mg/LKm+200mg/LCef)中进行增殖筛选。再生芽转入生根筛选培养基MS7(1/2 MS+25mg/LKm)中进行生根筛选。 3.几丁质酶基因的导入及转基因植株的鉴定 在建立起的石竹转化体系上,将几丁质酶基因导入石竹,叶片平均再生率力6.9%,共获得25株生根的抗性植株。PCR检测显示,其中5株显示PCR阳性。田间的性状观察显示,转基因植株对叶斑病具有一定的抗性。