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Trpm8是一种前列腺特异性基因,编码一种能通透Ca2+的阳离子通道。TRPM8在前列腺上皮细胞中的表达受雄激素受体的调控。在未接受抗雄激素治疗的前列腺癌病例,其表达水平较正常组织显著增加,而且其表达水平与前列腺癌的分级和分期密切相关；在接受抗雄激素治疗的病例,以及雄激素非依赖性前列腺癌细胞,其表达又随雄激素受体活性降低而下调。TRPM8在正常前列腺上皮细胞和雄激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞中均有表达,而且为这些细胞存活所必需；同时,应用TRPM8通道激动剂menthol又能降低LNCaP细胞的活性,从而抑制其增殖；然而在雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞中,TRPM8低表达或不表达。TRPM8通道对于前列腺上皮细胞增殖和分化的影响,以及在前列腺癌发生和发展中的作用尚未阐明。本课题旨在构建全长TRPM8表达载体,并通过基因调控的方法,探讨TRPM8对雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移、以及抗凋亡能力的影响,从而探索雄激素非依赖性前列腺癌基因治疗的可能性。目的：构建全长trpm8基因的真核表达载体pcDNA3/TRPM8并转染雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞,筛选稳定表达TRPM8的细胞系PC-3-TRPM8。检测TRPM8通道的功能,并探讨TRPM8通道对PC-3细胞增殖的调控作用,以及其对PC-3细胞迁移和抗凋亡能力的影响。方法：按照标准DNA重组操作,以大鼠cDNA文库为模版,用PCR方法扩增得到全长大鼠TRPM8基因,并在两端分别引入BamHⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点,构建基于pcDNA3质粒的TRPM8真核表达载体pcDNA3/TRPM8;经酶切和基因测序证实后,用脂质体法瞬时转染COS-7细胞,RT-PCR及Western blot检测TRPM8 mRNA和蛋白的表达情况。分别将空载体pcDNA3和pcDNA3/TRPM8转染至PC-3细胞,筛选出稳定表达细胞系pcDNA3-Vector和PC-3-TRPM8.分别通过Western blot和免疫荧光检测TRPM8蛋白在PC-3-TRPM8细胞的表达水平和细胞内的分布；通过钙成像技术检测TRPM8通道的功能；通过流式细胞术和细胞划痕实验检测TRPM8对PC-3细胞的周期分布、细胞迁移、以及抗凋亡能力的影响。结果：酶切和基因测序表明获得了和理论上大小一致、序列相同的片段；载体瞬时转染COS-7细胞后,RT-PCR及Western blot表明mRNA和蛋白的表达增强,提示载体成功构建。大鼠和人TRPM8基因序列Blast分析表明两类基因高度同源。Western blot和钙成像分析表明PC-3-TRPM8细胞高表达TRPM8通道蛋白,该TRPM8通道能被menthol激活,在含Ca2+溶液和无Ca2+溶液均能提高细胞内Ca2+浓度；menthol同样能提高PC-3-Vector细胞内Ca2+浓度,但其在含Ca2+和无Ca2+溶液中Ca2+升高幅度显著低于相应溶液中PC-3-TRPM8(p<0.01)。免疫荧光提示TRPM8蛋白分布于PC-3-TRPM8细胞的胞膜和胞浆。细胞周期检测表明PC-3, PC-3-Vector,以及PC-3-TRPM8位于G0/G1期百分率分别为52.62%,56.98%,以及71.99%(p<0.05)；经含1%FBS RPMI-1640培养48h后,PC-3, PC-3-Vector,以及PC-3-TRPM8细胞凋亡率分别为5.25%,5.51%,以及12.4%(p<0.01)。划痕实验表明,划痕24h后,3组细胞的迁移率分别为100%,92.59%,以及58.73%(p<0.01)。Western blot提示与PC-3-Vector相比,PC-3-TRPM8组细胞Cdk4、Cdk6、以及FAK-p-Y397蛋白表达降低。结论：成功构建了基于pcDNA3的真核表达载体pcDNA/TRPM8。Menthol能激活PC-3-TRPM8细胞胞膜和内质网TRPM8通道,通过细胞外Ca2+内流和/或内质网内Ca2+库释放引起细胞内Ca2+浓度升高；高表达的TRPM8能通过下调Cdk4和Cdk6表达,抑制FAK激活而抑制PC-3细胞的增殖和迁移,并易化其凋亡,其机制可能与高表达的TRPM8破坏了PC-3细胞内Ca2+稳态有关。因此TRPM8通道或许能成为前列腺癌治疗的一个新标靶。