基因治疗作为一种处于成长期的应用技术,有多种实施技术路线,目前临床研究中有大约70%的基因治疗采用的是病毒载体,这类载体极大地促进了基因治疗技术的进步,但是其可能存在的致癌性和免疫原性、广泛趋向性,大大降低了其临床应用的安全性。因此,聚合物基因载体已经成为这一领域中的研究热点和主流方向。聚合物非病毒类基因载体能够高效地包载基因片段,具有良好的跨膜能力,便于进行靶向性及生物适用性改性,易于工业化生产和质量控制,无免疫原性,安全性较高,但是也存在着转染效率低,体循环稳定性差,基因释放率低,细胞毒性大等问题。针对聚合物基因载体面临的现实问题,课题组选取四种新型胍基化试剂:盐酸胍(CAR)、醋酸氯己定(CHL)、硫酸胍基丁胺(AGM)和L-精氨酸(ARG),优化胍基化修饰的合成路线,采用一步迈克尔加成聚合法,拟构建新型胍基化的含二硫键的聚氨基胺类聚合物(Gua-SS-PAAs)作为基因转运的载体。该类载体具有细胞内还原敏感性释放外源基因的能力,并且胍基化后,使得该类载体具有更好的膜透过性和精确的核定位效应,选择的新型胍基化试剂使得载体在降解后细胞毒性较低。采用一步迈克尔加成聚合法制备出CAR-CBA,CHL-CBA,AGM-CBA,ARG-CBA四种聚合物载体。其中,CAR和CHL单体在进行一步胍基化迈克尔加成聚合之前,先用Pbf-Cl激活二者胍基氮原子的反应活性,生成能够进行加成聚合反应的仲氨基结构,再同N,N-双(丙烯酰)胱胺(CBA)进行加成聚合反应,最后脱去保护基团;AGM和ARG利用其自身的伯胺基结构直接进行加成聚合反应。最终的聚合产物用1HNMR、MS、GPC等方法对其进行结构确证,分子量测定。结果表明,四种聚合物载体构建成功。为了评价所构建的聚合物载体作为RNAi和cDNA转染的两种基因治疗路线的载体的性能,所制备的四种Gua-SS-PAAs聚合物载体分别包载pcDNA3.1-EGFP和pSliencerTM 4.1-CMV-FANCF-shRNA两种质粒,并选取 PEI 和Lipofectamine 2000两种不同的转染试剂作为阳性对照载体。用荧光包封率、DLS、AFM、琼脂糖凝胶电泳等方法检测基因/载体复合物的粒径、Zeta电位和外观。实验结果表明,四种聚合物载体对两种质粒的包封率均较高(>60%),粒径<90 nm,Zeta 电位<30 mV,并且在一定 N/P(pDNA/polymer,weight ratio)比情况下,它们的粒径和Zeta电位均小于对照载体;此外,无论在干燥或者缓冲溶液环境中,基因/载体复合物均为颗粒状的实体结构。采用琼脂糖凝胶电泳对四种聚合物载体包载两种质粒后,复合物的包载稳定性进行评价,结果表明聚合物载体对两种质粒的结合力较强,能够对抗血清中荷负电的蛋白因子的作用,并能够抵抗DNA酶的降解。还原敏感性释放实验结果表明,四种聚合物载体在模拟细胞内还原环境的条件下,能够实现还原敏感性释放外源DNA,结合体外转染效率实验结果分析,释放出的外源pDNA片段结构和功能没有发生显著变化。四种聚合物载体包载两种质粒所形成的复合物体外转染和细胞毒性实验表明,复合物在适当的N/P比(1/48左右)时,转染效率(均>70%)大于两种阳性对照载体(均<60%),细胞活力水平维持在50%以上,细胞毒性低于两种阳性对照载体(细胞活力在40%左右)。四种聚合物载体包载两种质粒所形成的复合物细胞摄取实验表明,复合物进入细胞的速度和数量明显大于两种阳性对照载体;而且四种复合物跨膜转运表现出了独特的机制,乳酸脱氢酶释放及转运机制研究结果表明,复合物载体主要是通过细胞膜"打孔效应"进入细胞的;内涵体逃逸实验结果表明:复合物的胞内转运过程部分通过内涵体逃逸过程,并且内涵体逃逸不是复合物胞内转运的限速过程;核定位实验结果表明,pDNA在细胞核内的分布具有数量差异和区域差异。对不同载体包载不同质粒形成的基因/载体复合物(CAR-/CHL-AGM-ARG-CBA-pcDNA3.1-EGFP;CAR-/CHL-/AGM-/ARG-CBA-pSliencerTM 4.1-CMV-FANCF-shRNA)进行横向对比研究发现:聚合物载体结构不同,包载的质粒种类不同,所形成复合物的粒径、Zeta电位、外观、包载稳定性、细胞毒性,甚至转运机制均存在一定的差异,并通过上述载体性质的差异性,最终影响其转染效率;同种聚合物载体的转染效率差异,依据不同的N/P比,呈现明显的剂量依赖性,并且上述相关性质也会发生变化。总体来说,聚合物载体中较复杂的侧链结构,较多的胍基功能团能够使基因/载体复合物拥有更小的粒径,更高的包载稳定性,更低的细胞毒性及更高的转染效率。复合物在细胞核内分布的区域差异和数量差异是影响转染效率的重要因素。综上所述,所构建的四种聚合物基因载体具有良好的应用前景。该研究为此类载体的设计、构建、筛选奠定了实验和理论基础。