幽门螺杆菌（Helicobacterpylori,H.pylori）为人类胃部疾病的重要致病菌之一，世界范围内感染率达到50％。已证实，H.pylori感染与多种胃肠道疾病的发生密切相关，例如慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃粘膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤。Ⅰ型H.pylori菌株因携带cag致病岛(cagpathogenicityisland，cagPAI)而致其毒性较强。致病岛编码的Ⅳ型分泌系统能够合成并转运H.pylori重要的毒力因子-细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxin-associatedgeneA，CagA)进入到宿主细胞内导致细胞功能紊乱。本文选择了该组基因中的第一号基因cag1作为研究对象，通过微生物学、分子生物学、免疫学和生物信息学等技术探讨cag1基因的功能，为深入研究cag致病岛的功能和致病机制奠定基础。　　 方法:　　 1.根据已报道的H.pylori26695全基因序列，利用PrimerPremier6.0设计cag1全长基因引物，用PCR方法从H.pylori11637基因组DNA中扩增目的基因片段，T-A克隆后构建pMD18-T-cag1载体，完成测序工作;使用生物信息学软件:DNAStar、ProtParam、ANTHEPROT5.0和SignalP4.1server对其基本的理化性质和信号肽进行预测分析，同时使用Tmpred、TMHMMv2.0和SOSUI对该蛋白的跨膜区域进行预测。　　 2.使用PrimerPremier6.0设计去信号肽后的cag1基因引物，并构建原核表达载体pET-32a-cag1，将质粒转化入表达工程菌Rosetta(DE3);经IPTG诱导后，确定蛋白是否可溶，大量诱导蛋白后，使用QIAGEN系统Ni2+-NTA柱纯化目的蛋白。SDS-PAGE电泳、Westernblot分析和质谱方法鉴定目的蛋白。　　 3.纯化后的Cag1融合蛋白免疫家兔，制得兔抗Cag1多克隆抗血清，酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)测定抗体效价。　　 4.利用同源重组原理，设计PCR引物并扩增cag1基因上下游同源臂片段，构建cag1基因缺陷自杀质粒pBlueKM40-Δcag1::kan，电转化进入H.pyloriNCTC11637中，通过抗性筛选出阳性克隆，并使用PCR方法验证后，即获得cag1基因缺陷株。　　 5.将H.pyloriNCTC11637细菌菌体收集并裂解菌体，使用超高速低温离心机对H.pylori进行亚细胞分离，分为膜组分（包括内膜和外膜）、胞质组分和周质组分，包括周质间隙蛋白、胞质蛋白及膜蛋白，使用Westernblot方法，以兔抗Cag1多克隆抗体为一抗，检测Cag1蛋白亚细胞定位。　　 6.将cag1基因缺陷株与NCTC11637野生株分别与胃上皮细胞GES-1共培养后，检测CagA蛋白转运量，研究cag1基因缺陷对CagA蛋白转运的影响。　　 7.收集cag1基因缺陷株与NCTC11637野生株，裂解后得到细菌全菌蛋白，分别使用Westernblot方法检测cag致病岛重要编码蛋白CagX、CagM、CagL和CagI的表达量，研究cag1基因对这些蛋白合成与稳定的影响。　　 结果:　　 1.H.pyloriNCTC11637菌株cag1基因全长为348bp，编码蛋白长度为115aa，其相对分子质量为12.42kDa，等电点为8.58。该蛋白属于稳定且亲水性的蛋白。在蛋白两端存在多个亲水区域，而蛋白的中段则是疏水的跨膜区域。预测该蛋白存在信号肽，位置在N端的前21个碱基，在21至22的位置处断裂。并且存在一个跨膜区域，位于蛋白中段，两端亲水，极可能游离于膜外。　　 2.成功构建原核表达载体pET-32a-cag1，在大肠杆菌中异源表达，获得大量目的蛋白Cag1。并通过QIAGEN系统纯化目的蛋白，利用质谱技术对蛋白进行鉴定。将纯化后的蛋白免疫家兔制备了兔抗Cag1多克隆抗体，效价为1∶3.2×105。　　 3.成功构建cag1基因敲除重组自杀质粒:pBlueKM40-Δcag1::kan。电转化自杀质粒进入H.pyloriNCTC11637菌体内，通过卡那霉素抗性筛选出同源重组成功的菌株，即为H.pyloricag1基因缺陷株:Δcag1。并用PCR方法以及对PCR产物进行测序的方法验证。　　 4.以兔抗Cag1多克隆抗体为一抗作Westernblot分析，确定Cag1位于菌体膜部分;H.pylori与GES-1细胞共培养，检测CagA蛋白转运量，结果显示cag1基因缺陷株CagA转运量比野生株少，但仍具有转运CagA的能力;比较H.pylori野生株和cag1基因缺陷株中四种已知Cag-T4SS重要的结构蛋白的表达量。结果显示CagX、CagM、CagL和CagI蛋白表达水平没有明显差异。　　 结论:　　 1.成功克隆了cag1全长基因，使用生物信息学方法了解其编码蛋白的理化性质，并预测了其存在的信号肽和跨膜区域。　　 2.成功构建了cag1基因原核表达载体pET-32a-cag1，通过IPTG诱导获得和纯化了大量目的蛋白，免疫家兔后，制备了兔抗Cag1蛋白的多克隆抗体。　　 3.成功构建了自杀质粒pBlueKM40-Δcag1::kan，并且获得了一株cag1基因缺陷株Δcag1。　　 4.确定了Cag1蛋白的亚细胞定位，位于菌体膜部位;证明了cag1基因缺失并没有使H.pylori丧失CagA蛋白转运的能力，但其转运量明显减少;证明了cag1基因缺失对CagX、CagM、CagL和CagI这四种Cag-T4SS重要的结构蛋白的表达和稳定没有影响。