目的观察肿瘤浸润性CD8⁺T细胞表面抑制性分子PD-1（programmed death 1,PD-1）的表达水平,探讨SNX25（sorting nexin 25,SNX25）在肿瘤浸润性CD8⁺T细胞中分拣PD-1进入外泌体（exosomes）的能力以及其对CD8⁺T细胞抗肿瘤免疫中的作用。方法（1）采用免疫磁珠法分选野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏、荷瘤小鼠肿瘤组织来源CD8⁺T细胞,流式细胞术（FCM）鉴定细胞纯度。利用流式细胞术和Western-blot检测野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏、荷瘤小鼠肿瘤组织来源CD8⁺T细胞中PD-1的表达情况。将小鼠CT26结肠癌细胞培养上清（tumor cell conditioned medium,TCCM）加入小鼠脾脏来源CD8⁺T细胞培养孔中,检测细胞表面PD-1表达的变化情况。（2）免疫磁珠法分选野生型小鼠脾脏来源CD8⁺T细胞（WT-sp-CD8）、荷瘤小鼠脾脏来源CD8⁺T细胞（TU-sp-CD8）以及荷瘤小鼠肿瘤组织来源CD8⁺T细胞（TIL-CD8）,分别接种在预包被1?g/mL抗小鼠CD3、CD28抗体的24孔板中,37℃、5%CO₂培养24h,收集培养上清,分别提取不同CD8⁺T细胞来源的exosomes。透射电子显微镜观察CD8⁺T细胞来源的exosomes的形态,纳米颗粒跟踪分析仪检测exosomes粒径分布,Western blot检测exosomes相关蛋白及PD-1的表达,FCM检测exosomes表面分子。检测经TCCM处理的野生型小鼠脾脏CD8⁺T细胞来源exosomes中PD-1的表达情况。（3）Western blot检测野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏、荷瘤小鼠肿瘤组织来源CD8⁺T细胞中SNX25的表达。采用蛋白质免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）检测CD8⁺T细胞中PD-1与SNX25是否相互结合,进一步观察WT-sp-CD8、TU-sp-CD8和TIL-CD8中两者结合情况的变化。CD8⁺T细胞经TCCM处理,Western blot检测细胞中SNX25的表达变化,以及PD-1与SNX25的结合的变化情况。（4）利用免疫荧光技术观察CD8⁺T细胞中PD-1、SNX25与早期内体（EEA1）、晚期内体（CD63）的定位,了解SNX25在exosomal PD-1分拣中的可能作用。（5）为了探究SNX25在exosomal PD-1分拣中的作用,采用小鼠SNX25特异性siRNA敲减野生型小鼠脾脏来源CD8⁺T细胞中的SNX25后,FCM检测CD8⁺T细胞表面分子PD-1的表达,Western blot检测CD8⁺T细胞来源外泌体中PD-1含量的变化。（6）为了探究SNX25在exosomal PD-1分拣中的作用,采用慢病毒过表达SNX25后,FCM检测CD8⁺T细胞表面分子PD-1的表达,Western blot检测CD8⁺T细胞来源外泌体中PD-1含量的变化。结果（1）免疫磁珠法分选的小鼠脾脏和肿瘤组织来源的CD8⁺T细胞纯度均超过90%以上。与野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏来源CD8⁺T细胞相比,肿瘤浸润性CD8⁺T细胞表面PD-1异常高表达。TCCM处理后,野生型小鼠脾脏来源CD8⁺T细胞表面PD-1的MFI值在第2天达到峰值为23826±2153.6,而对照组PD-1的MFI值为2731±226.27。（2）在透射电子显微镜下CD8⁺T细胞来源exosomes呈圆形或椭圆形茶托样结构,exosomes直径主要分布在100 nm左右,Western blot检测发现其表达CD63、Hsp70等特征性分子,不表达Calnexin分子,流式检测发现exosomes表面表达CD8、CD25以及PD-1等分子。且我们发现肿瘤浸润性CD8⁺T细胞来源exosomes中PD-1的含量较野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏CD8⁺T细胞来源exosomes减少。TCCM处理后,野生型小鼠脾脏CD8⁺T细胞来源exosomes中的PD-1明显减少。（3）Co-IP检测发现CD8⁺T细胞中PD-1与SNX25相互结合。与野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏来源CD8⁺T细胞相比,肿瘤组织来源CD8⁺T细胞中PD-1与SNX25结合减少。TCCM处理后,野生型小鼠脾脏CD8⁺T细胞中PD-1与SNX25结合减少。（4）CD8⁺T细胞中PD-1、SNX25与早期内体（EEA1）、晚期内体（CD63）结合。（5）敲减野生型小鼠脾脏CD8⁺T细胞中的SNX25后,CD8⁺T细胞分泌的exosomes中PD-1含量下降,而CD8⁺T细胞表面PD-1的表达上调。（6）过表达野生型小鼠脾脏CD8⁺T细胞中的SNX25后,CD8⁺T细胞分泌的exosomes中PD-1含量增加,而CD8⁺T细胞表面PD-1的表达下调。结论肿瘤浸润性CD8⁺T细胞中经SNX25分拣进入外泌体的PD-1分子减少,导致CD8⁺T细胞经exosomes途径向胞外环境释放的PD-1分子减少,从而使得CD8⁺T细胞表面的PD-1表达水平升高。