急性肝损伤（actue liver injury，ALI）可由多种原因引起，主要病理特征为肝组织内单核巨噬细胞广泛受损而致的肝组织充血水肿，临床上可表现为肝功能下降，黄疸，贫血和低蛋白血症等，进一步发展至急性肝功能衰竭。多种病因（包括肝内/肝外，感染/非感染）都能直接或间接引起急性肝功能衰竭。革兰氏阴性细菌内毒素的主要活性成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是导致肝脏感染和全身感染的主要因素。LPS刺激肝细胞分泌炎性因子而介导启动机体的炎症反应，进而导致全身性炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），在肝脏可表现为ALI。然而对于LPS启动机体炎症反应，导致ALI的具体机制尚未完全阐明。　　 氢气是无色、无嗅、无味、具有一定还原性的双原子气体。在生物医学界，过去氢气一直被认为属于生理性惰性气体而仅仅用于潜水医学领域。自从Ohsawa等[1]发现氢气具有抗氧化抗凋亡的特点，可以通过选择性的中和羟自由基保护缺血再灌注损伤和休克以来，氢气作为治疗性医学气体成为了研究热点。大量的生物医学临床和动物实验研究表明，无论氢气是通过呼吸还是通过水溶液（可制成饱和氢生理盐水，简称富氢水）进入机体都可以作为选择性羟自由基和亚硝酸阴离子清除剂产生细胞保护作用。有研究表明氢气对器官缺血再灌注损伤有保护作用，但其机制尚未完全阐明，仍存在许多问题亟待解决。　　 内源性气体信号分子是一类具有多种生理和病理生理作用的生物物质，它们的发现为ALI发病机制的研究开辟了一个新的领域。迄今已证实的内源性气体信号分子有三种，即一氧化氮(nitric oxide,NO)，一氧化碳（carbon monoxide，CO）和硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)。H2S是继NO和CO之后被确认的第三种内源性气体信号分子。它是由含硫氨基酸被磷酸吡多醛-5’-磷酸依赖性酶[包括胱硫醚-β-合酶(cystathionine-β-synthase，CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)]等催化产生的。已有研究证实H2S参与了神经和血管等的生理功能调节，以及高血压、肺动脉高压、内毒素休克等疾病的发生。所以，本研究中，我们旨在探明H2S在LPS所致ALI中所发挥的作用及机制。　　 研究表明，肝脏内单核-巨噬细胞的活化和损伤在LPS所致的ALI中发挥重要作用。LPS介导的肝库否氏细胞活化的信号通路错综复杂，目前认为LPS-TNF-α-JNK-IκB-NF-κB是其中一条关键的信号通路，即LPS激活肝内库否氏细胞产生并释放大量的细胞因子TNF-α和ROS等，而这些因素可以直接激活肝细胞中JNK促使iκbα磷酸化降解，然后顺次激活下游激酶(NF-κB诱导激酶，NF-κB-inducing kinase，NIK)，激活的NIK能独自激活IKK复合物，导致IκB磷酸化降解，NF-κB移位入核，导致细胞因子TNF-α，IL-6等转录，合成增加，白细胞活化浸润，加重肝炎症反应和肝损伤。　　 富氢水对LPS诱导的大鼠肝组织中CSE表达有何作用，它是否通过调控CSE/H2S来发挥细胞保护作用，以及TNF-α-JNK-NF-κB通路是否参与富氢水对LPS诱导的CSE表达的调控均未见报道。本研究通过观察富氢水对LPS所致的ALI的保护作用，以及CSE/H2S对富氢水在该过程中作用的影响及TNF-α/JNK/NF-κB通路在此过程中的作用，以探讨CSE/H2S体系在富氢水抗LPS所致的ALI中的作用，为临床防治ALI提供新的对策。　　 1内、外源性H2S在富氢水减轻内毒素所致急性肝损伤中的作用本部分实验的目的是观察内、外源性H2S在富氢水抗LPS所致的ALI中的作用。将84只雄性SD大鼠随机分为7组（每组12只）:①对照组:尾静脉注射等体积的生理盐水（与LPS的体积相同）;②LPS组:尾静脉注射LPS10mg/kg（lmg/ml）;③NaHS(H2S供体)+LPS组:在注射LPS（剂量同前）前10min经腹腔注射0.5mlNaHS(28μmol/kg);④PPG（炔丙基甘氨酸，CSE抑制剂）+LPS组:在注射LPS（剂量同前）前10min经腹腔注射0.5mlPPG(45μmol/kg);⑤H2+LPS组:在注射LPS（剂量同前）前20min经腹腔注射H2水8ml/kg，注射LPS之后每隔1h给予H2水8ml/kg连续5次;⑥PPG+H2+LPS组:在注射LPS（剂量同前）前20min先腹腔注射H2水（剂量，用法同前），10min后再腹腔注射PPG（剂量同前）;⑦H2组（H组）:在注射生理盐水前20min经腹腔注射H2水（剂量，用法同前）。连续观察6h，留取血浆以检测肝生化指标，TNF-α水平及H2S含量，留取肝右叶，用于制备肝组织匀浆以测定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，谷胱甘肽(glutathione，SGH)含量，部分肝组织用于提取组织总蛋白以Western blot方法测定Smac和Caspase-3，4％多聚甲醛固定部分肝右叶，常规石蜡包埋，切片，经HE染色以观察肝组织形态学改变。　　 结果发现:①注射LPS后，大鼠血清中ALT, AST, TBIL和TNF-α水平与对照组相比显著升高(P＜0.05)。可见肝组织正常结构破坏，炎细胞浸润，肝细胞呈广泛气球样变，其数量明显高于对照组(P＜0.05)。与对照组比较，LPS可使肝组织Smac和Caspase-3蛋白表达显著增加(P＜0.05)，肝组织中MDA含量升高(P＜0.05)，GSH含量显著下降(P＜0.05)。　　 ②与LPS组相比，H2+LPS和NaHS+LPS组血清中肝功酶和TNF-α水平显著降低(P＜0.05)。肝细胞气球样变数量明显减少(P＜0.05)。肝组织中Smac和Caspase-3蛋白表达明显减少(P＜0.05)，肝组织MDA含量降低(P＜0.05)，GSH含量显著升高(P＜0.05)。PPG可使肝组织中Smac和Caspase-3表达明显增加(P＜0.05)，肝组织MDA含量增加(P＜0.05)，GSH含量减少(P＜0.05)，加重LPS导致的肝组织损伤的程度并抑制富氢水的保护作用。　　 ③注射LPS引起ALI时，血浆中H2S含量减少。富氢水和NaHS可逆转LPS的上述作用，与LPS组相比，其血浆中H2S含量增加(P＜0.01)。PPG则促进LPS对H2S的下调作用(P＜0.05)。　　 以上结果表明，LPS可引起明显的肝组织损伤并下调H2S的生成量。应用富氢水和H2S供体NaHS可上调H2S，并减轻肝损伤。提示富氢水细胞保护作用的发挥与H2S的产生之间可能具有某种内在联系，它可能通过增加H2S的产生来发挥抗氧化、抑制TNF-α分泌等作用，从而改善了LPS诱导的肝损伤。　　 2 CSE/H2S体系在富氢水减轻内毒素所致的急性肝损伤中的作用机制　　 2.1富氢水减轻内毒素所致大鼠急性肝损伤过程中肝组织CSE表达的变化本部分实验的目的是观察富氢水改善LPS所致的肝损伤过程中肝组织CSE活性和CSE mRNA表达的变化，以阐明富氢水调控LPS诱导H2S生成的分子机制及其可能的生物学意义。将48只雄性SD大鼠随机分为4组（每组12只，给药方法同前）:①对照组:方法同第一部分①;②LPS组:方法他第一部分②;③H2+LPS组:方法同第一部分⑤;④H2组:方法同第一部分⑦，于给药后6h处死。取肝右叶部分用于制备肝组织匀浆以检测CSE活性，部分用于提取组织总RNA以RT-PCR方法检测CSE mRNA的表达。　　 结果如下:与对照组相比，LPS组大鼠肝组织CSE mRNA表达减少，CSE蛋白活性下降(P＜0.05)。与LPS组相比，H2+LPS组肝组织CSE mRNA表达增多，CSE蛋白活性升高;与对照组相比，H2组大鼠肝组织CSE活性及CSE mRNA表达无明显改变(P＞0.05)。　　 结合第一部分的结果提示，H2S/CSE体系参与了LPS所致ALI的病理生理过程。富氢水可能通过上调CSE mRNA表达和蛋白活性而发挥肝保护作用。富氢水增加LPS所致ALI大鼠肝组织中H2S的产生有可能是通过CSE表达上调而实现的。　　 2.2JNK/SAPK通路在富氢水上调内毒素所致急性肝损伤大鼠肝组织CSE表达中的作用及对NF-κB的影响　　 本部分实验的目的是通过观察应用JNK特异性抑制剂SP600125进一步探讨富氢水上调ALI大鼠肝组织中CSE表达的信号转导机制。将84只大鼠，随机分为7组，每组12只。①对照组:方法同第一部分①;②LPS组:方法同第一部分②;③SP600125（JNK抑制剂）+LPS组:在注射LPS前30min经腹腔注射SP6001255mg/kg;④H2+LPS组:方法同第一部分⑤;⑤SP600125+H2+LPS组:在注射LPS前30min经腹腔注射SP600125（剂量同前），前20min腹腔注射H2水（剂量同前）;⑥H2组:方法同第一部分⑦;⑦SP600125组（S组）:在注射生理盐水前30min经腹腔注射SP600125（剂量同前）各组给药6h后麻醉取材（方法同前）。　　 结果发现，JNK特异性的抑制剂SP600125进一步上调了富氢水诱导的CSEmRNA表达和CSE蛋白活性，提示JNK通路在富氢水上调LPS所致ALI大鼠肝组织CSE表达过程中发挥重要作用;SP600125和富氢水抑制了肝组织NF-κB蛋白表达，降低了血清中TNF-α水平，提示CSE对JNK-NF-B通路可能具有重要的调节作用。　　 结论：　　 本实验观察了CSE/H2S体系在富氢水减轻LPS所致ALI中的作用，并探讨了在此过程中的信号转导机制，为其在临床上应用提供了新的、可靠的动物实验依据。　　 1 LPS可引起明显的肝组织损伤，同时血浆H2S含量下降;抑制内源性H2S的产生，可加重LPS所致的ALI，提示H2S具有抗肝损伤作用，其机制可能与其抑制TNF-α的分泌及由此引起的炎症反应和氧化损伤有关。富氢水可减轻肝损伤的同时上调血浆H2S含量。富氢水细胞保护作用的发挥与内源性H2S生成之间可能具有某种内在联系。　　 2富氢水通过上调CSEmRNA和CSE蛋白表达增加而发挥肝保护作用。并在整体水平证实富氢水上调CSE表达可能是通过JNK信号通路进行调控的。在这一过程中，JN对NF-κB可能存在重要的的调节作用。