论文部分内容阅读
背景及目的纳米氧化锌(Zinc oxide nanoparticles,ZnO-NPs)是一种粒径在1~100 nm的金属氧化物,具有纳米材料的宏观量子隧道效应、体积效应、表面效应等特性,可用于水泥、轮胎、颜料、纺织品、食品药品、油漆、润滑剂等工业生产中。随着纳米氧化锌的广泛应用,职业人群的暴露几率也大大增加。研究表明,纳米氧化锌能够通过呼吸道进入人体,沉积于支气管及肺泡中,引起炎性介质及细胞因子释放,炎性细胞浸润,诱发呼吸道炎症,但具体机制尚不清楚。外泌体(exosomes)是由细胞分泌的膜性囊泡,含有丰富的蛋白质、核酸物质,参与细胞通讯、免疫调节、氧化应激、炎症及肿瘤的发生发展。研究显示,外泌体主要是通过将携带的miRNAs传递给受体细胞,调控受体细胞靶基因的表达,改变细胞因子及炎症因子的表达水平,促进炎症的发生发展。那么纳米氧化锌是否会改变外泌体中的miRNAs呢?目前尚未有相关研究,有待进一步的探究证实。为探究纳米氧化锌所致的呼吸道炎症中外泌体miRNAs的表达,本实验通过超速离心法和试剂盒法分离血清外泌体,利用高通量基因芯片检测技术,筛选差异miRNAs,以期找到与纳米氧化锌所致呼吸道炎症密切相关的miRNAs。方法1.纳米氧化锌致呼吸道炎症:将SD大鼠随机分为4组:低(2 mg/ml)、中(4 mg/ml)、高(8 mg/ml)剂量纳米氧化锌染毒组和生理盐水对照组,采用气管滴注法连续染毒3 d,每天染毒1次,染毒结束后24 h,麻醉大鼠后经腹主动脉采血,检测血液白细胞分类,ELISA法测定各组血清IL-8、IL-1β、TNF-α;收集肺泡灌洗液,检测BALF中总蛋白及乳酸脱氢酶(LDH)活性;通过肺组织HE染色观察病理改变。2.外泌体的提取与鉴定:采用超高速离心法和试剂盒法提取血清外泌体,通过透射电镜观察外泌体形态结构,Western blot方法对外泌体特征性蛋白CD63、Alix进行鉴定。3.外泌体差异miRNAs的生物学信息检测及分析:用外泌体RNA提取试剂盒提取外泌体总RNA,通过去磷酸化、样品变性、连接标记、样品纯化,使用Agilent芯片杂交,芯片洗涤、扫描后对结果进行标准化处理,筛选差异miRNAs。结果1.纳米氧化锌诱发大鼠呼吸道炎症:(1)染毒后大鼠的基本情况:染毒结束后,纳米氧化锌染毒组大鼠出现精神萎靡,摄食量减少;染毒前后,生理盐水组大鼠体重增加,而各染毒组体重均减轻。(2)肺泡灌洗液中总蛋白及乳酸脱氢酶活性:与生理盐水对照组相比,低、中、高剂量染毒组乳酸脱氢酶活性、总蛋白含量均升高,并呈现一定的剂量依赖效应,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)纳米氧化锌对大鼠外周血细胞分类的影响:与生理盐水对照组相比,低、中、高剂量纳米氧化锌染毒组的外周血中白细胞总数、淋巴细胞数目、中性粒细胞及中性粒细胞百分比,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)大鼠血清细胞因子IL-8、IL-1β、TNF-α的变化:低、中、高剂量纳米氧化锌染毒组大鼠血清中IL-8、IL-1β、TNF-α水平均高于生理盐水对照组(P<0.05)。(5)肺组织病理学改变:生理盐水组肺泡结构清晰,少有结构破坏;低剂量组伴轻微炎细胞浸润和少量渗出物形成;中剂量组炎性细胞浸润和渗出物明显增多,肺实变面积增加;高剂量组肺泡壁充血水肿,肺组织完全实变。2.大鼠血清来源外泌体的提取与鉴定:超高速离心法和试剂盒法均能提取到血清外泌体,通过透射电镜观察到外泌体大小均匀,呈椭圆形或圆形,并表达外泌体特征性蛋白CD63和Alix。3.外泌体miRNAs芯片分析:miRNA芯片共筛选出23种差异表达的miRNAs,其中16种表达上调,7种表达下调,其中miR-134-5p、miR-290、miR-130a-3p、miR-19a-3p、miR-223-3p在炎症发生发展中发挥重要作用。结论1.纳米氧化锌诱发了大鼠呼吸道炎症,并改变其血清外泌体miRNA的表达。2.纳米氧化锌诱发的呼吸道炎症中,外泌体可能通过miR-223-3p、miR-134-3p、miR-130a-3p、miR-30b-5p调控炎症反应。