奥沙利铂（Oxaliplatin OXA）是临床常用的一种化疗药，主要用于睾丸、卵巢、子宫颈、结肠和前列腺癌症的治疗。但很多化疗患者在接受OXA治疗后会出现周围神经病变，部分患者会发展为慢性周围神经病变。冷触痛是OXA引起周围神经病变最特异的症状。OXA诱导的神经病理性疼痛严重影响患者生活质量，因目前并没有有效的预防和治疗方法，极大限制了OXA的临床应用，为了解决这一难题需要加深对OXA诱导神经病理性疼痛发病机制的研究，为临床治疗提供理论依据。本研究在小鼠体内腹腔注射OXA来诱导出周围神经病理性疼痛，检测到OXA诱导的周围神经病理性疼痛小鼠背根神经节（Dorsal Root Ganglion DRG）中神经元的钠离子电流增加、钠离子通道Nav1.6的表达增加的同时去甲基化酶TET1表达减少，因此，进一步研究Nav1.6表达增加的机制与TET1的调控是本研究的主要内容，该研究将为OXA诱导的周围神经病理性疼痛的治疗提供靶点。　　研究目的：　　探讨由OXA诱导的周围神经病理性疼痛中，神经元钠离子电流增加和Nav1.6表达增加的调控机制，为OXA诱导的周围神经病理性疼痛的临床治疗和预防提供理论依据。　　研究方法：　　1.建立由OXA诱导的周围神经病理性疼痛的小鼠模型　　模拟临床上的用药方案，每周2次，共4次，给予C57BL6小鼠腹腔注射OXA建立动物模型，检测小鼠0d、1d、2d、6d、8d、10d、14d、17d的行为学变化。　　2.电生理检测急性分离的DRG神经兴奋性　　急性分离及培养小鼠双侧L4～L6背根神经节神经元，用全细胞电流钳记录神经元的静息膜电位、动作电位最小刺激电流、动作电位阈值、动作电位峰值、幅度、超射值等数据分析OXA诱导的神经病理性疼痛中DRG神经元的兴奋性变化。　　3.电生理检测OXA模型小鼠DRG神经元钠离子电流变化　　急性分离及培养小鼠双侧L4～L6背根神经节神经元，利用全细胞电压钳技术，检测细胞膜上的钠离子电流变化。　　4.检测OXA模型小鼠DRG中钠离子通道表达变化　　注射OXA17d后取材，应用qRT-PCR检测模型小鼠DRG组织中的Nav1.3、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9的mRNA的表达变化。　　5.检测注射不同剂量的OXA小鼠DRG中Nav1.6表达的变化　　根据小鼠注射OXA的剂量差异，分组为3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg三个剂量组，造模成功后取L4～L6DRG，用western-blot的方法检测Nav1.6的表达变化。　　6.检测不同剂量OXA模型小鼠DRG中TET1的表达变化　　根据小鼠注射OXA的剂量差异，分组为3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg三个剂量组，造模成功后取L4～L6DRG用western-blot的方法检测TET1的表达变化。　　7.检测OXA模型小鼠DRG中miR-30b的表达变化和miR-30b启动子区的羟甲基化水平变化，并用双荧光素酶报告基因载体验证miR-30b与SCN8A的3UTR结合　　利用qRT-PCR的方法检测OXA模型小鼠DRG中miR-30b的表达变化，取模型鼠L4～L5的DRG组织并提取DNA,利用hMeDIP-PCR的技术方法，来检测OXA诱导的周围神经病变模型中miR-30b启动子区的羟甲基化水平变化。构建SCN8A3UTR区的双荧光素酶报告基因载体质粒，在PC12细胞中共转染miR-30b agomir和质粒，然后检测荧光强度变化，确定miR-30b是否与SCN8A的3UTR端结合。　　8.敲除小鼠DRG中TET1后对疼痛的影响　　在TET1LoxP小鼠左侧L4～L5DRG显微注射携带Cre酶基因的慢病毒，条件性敲除TET1,检测TET1表达是否降低，并检测成功敲除小鼠的行为学变化。　　研究结果：　　1.建立OXA诱导的周围神经病理性疼痛模型成功。　　腹腔注射OXA后，检测其0d、1d、2d、6d、8d、10d、14d、17d机械痛、冷痛行为，结果显示在打药后第6天开始，OXA模型小鼠的机械痛阈值和冷痛阈值均明显下降（P＜0.001），并在打药后10d降到最低值（P＜0.001）。　　2.电生理检测OXA模型小鼠DRG神经元兴奋性增加　　急性分离及培养小鼠双侧L4～L6背根神经节神经元，用全细胞电流钳记录神经元的静息膜电位、动作电位最小刺激电流、动作电位阈值、动作电位峰值、幅度、超射值等数据，分析结果显示OXA诱导的神经病理性疼痛小鼠DRG神经元的动作电位数量增加，静息膜电位升高（P＜0.05）、诱发动作电位的最小输入电流降低（P＜0.001）。　　3.OXA模型组DRG神经元中的钠离子电流发生变化　　将小鼠L4～L6DRG神经元急性分离及培养，利用全细胞电压钳记录单个神经元的总钠电流及Nav1.6电流，统计结果显示，与sham组小鼠相比，OXA模型组小鼠的DRG神经元的总Nav电流（P＜0.05）和Nav1.6电流（P＜0.05）均显著增加。　　4.OXA模型组DRG神经元中的钠离子通道表达发生变化　　取第17天OXA动物模型的DRG组织，检测到模型组Nav1.6的mRNA表达明显升高，与对照组相比有统计学差异（P＜0.001），Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9的mRNA水平没有发生变化,与对照组相比没有统计学差异（P＞0.05）。　　5.注射不同剂量的OXA小鼠DRG中Nav1.6表达升高　　在注射OXA后17d取小鼠L4～L6DRG组织，检测不同打药剂量小鼠DRG神经元中Nav1.6蛋白的表达水平均明显升高，差异具有统计学意义，5mg/kg组比3mg/kg和4mg/kg组升高，差异有统计学意义（P＜0.05），3mg/kg与4mg/kg组之间无统计学差异。　　6.检测不同剂量OXA模型小鼠DRG中TET1的表达变化　　取小鼠L4～L6DRG组织，检测到与对照组相比，模型组小鼠DRG中TET1蛋白表达是明显下降的，与对照组相比有统计学意义（P＜0.001），但不同剂量组之间TET1蛋白表达无统计学差异（P＞0.05）。　　7.检测OXA模型小鼠DRG中miR-30b的表达下调和miR-30b启动子区的羟甲基化水平降低，并用双荧光素酶报告基因载体验证miR-30b与SCN8A的3UTR结合　　取小鼠L4～L6DRG组织，检测miR-30b的表达水平，与对照组相比，miR-30b的表达明显下降，差异有统计学意义（P＜0.001），利用hMeDIP-PCR的技术方法检测到miR-30b启动子区的羟甲基化水平是明显下调的，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。在PC12细胞中用双荧光素酶报告基因验证miR-30b是否与SCN8A的3UTR结合，结果显示只有野生型载体加入miR-30b agomir组的荧光强度下降，与对照组比有统计学差异（P＜0.001）。　　8.敲除TET1后对疼痛行为学产生影响　　在TET1FoxP小鼠左侧L4、L5的DRG中显微注射cre酶腺相关病毒，条件性敲除TET1后，检测小鼠的行为学变化，结果显示条件敲除小鼠在打cre酶后的21d出现机械痛敏和冷痛敏（P＜0.05）。　　研究结论：　　TET1在OXA诱导的神经病理性疼痛模型中起着重要作用。在OXA诱导的神经病理性疼痛中，TET1可能是通过影响miR-30b的启动子区甲基化水平，来影响miR-30b的表达，进而调控Nav1.6的表达参与疼痛。研究OXA诱导的神经病理性疼痛的表观遗传机制，为OXA诱导的神经病理性疼痛的临床治疗和干预提供新的靶点和理论依据。