【摘 要】
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不动杆菌（Acinetobacter）是一种革兰氏阴性短杆菌,当机体抵抗力下降时,可引起人体各组织器官的感染,甚至引起菌血症;也可引起牛、羊、马的肺炎、猫坏死性筋膜炎以及鱼类死亡等。近年,从病牛分离到不动杆菌频率增加,如病死肉牛肺分离到醋酸钙不动杆菌、肺炎牦牛支气管分离到鲍曼不动杆菌、患子宫内膜炎奶牛乳汁中分离到鲍曼不动杆菌等。2018年,我们从一群发生呼吸道疾病肉牛的鼻腔拭子中分离得到一优势菌株
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（2018YFD0501800）； 四川省科技计划项目（2018NZ0002）； 四川省科技计划项目（2019YFQ0012）:肉牛清洁生产与种养循环关键技术的研究与示范； 国家现代农业产业技术体系四川肉牛创新团队项目（SCCXTD-2020-13）；
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不动杆菌（Acinetobacter）是一种革兰氏阴性短杆菌,当机体抵抗力下降时,可引起人体各组织器官的感染,甚至引起菌血症;也可引起牛、羊、马的肺炎、猫坏死性筋膜炎以及鱼类死亡等。近年,从病牛分离到不动杆菌频率增加,如病死肉牛肺分离到醋酸钙不动杆菌、肺炎牦牛支气管分离到鲍曼不动杆菌、患子宫内膜炎奶牛乳汁中分离到鲍曼不动杆菌等。2018年,我们从一群发生呼吸道疾病肉牛的鼻腔拭子中分离得到一优势菌株为Acinetobater towneri（A.towneri）,并围绕该菌对小鼠的致病性以及其PCR检测方法开展了研究。1.牛源A.towneri的分离鉴定为了确定某肉牛场发生以体温升高、呼吸困难等为主症疾病的原因,采集病样分离得到优势菌株ZZC3-9,经对生化鉴定、16S r RNA测序及进化树分析,该菌株为A.towneri。该菌的对数生长期为6h-18h,稳定期为第18h-30h。2.牛源A.towneri对小鼠的致病性研究采用A.towneri菌液对小鼠进行腹腔注射后,2h即可引起小鼠出现精神沉郁、被毛粗乱、呼吸急促、眼部分泌物增多等症状。按1.0×109CFU/m L攻菌0.2m L,可引起小鼠死亡,死亡小鼠的脾脏淤血肿大;其半数致死量为2.89×109CFU/m L。组织学观察心肌纤维呈点状坏死;肝细胞轻微空泡变性;脾脏有弥散性坏死,白髓、红髓的细胞大量出现胞核碎裂现象;肺间质有少量炎性细胞浸润。3.牛源A.towneri PCR检测方法的建立及应用根据A.towneri高度保守基因Omp A的序列设计引物（F:5’-GACTGAGCCCGTAGAAGA-3’;R-:5’-ACAGTTGATTACCCACCC-3’）,并通过特异性、灵敏性以及退火温度等试验成功构建了A.towneri的检测体系:按2×Master Mix10μL,dd H 2O 11μL,模板菌株2μL,上下引物各1μL;反应程序为96℃7 min;95℃30 sec,50℃30 sec,72℃30sec,35个循环后72℃延伸10min;可获得401bp的特异性条带。最低检测限度8.7×105CFU/m L。对患呼吸道疾病的78份肉牛鼻腔拭子进行检测,A.towneri的阳性样本率为7.7%（6/78）,阴性样本率为92.3%（72/78）;与采用传统细菌分离鉴定方法对A.towneri检出率吻合度高达到98.7%。4.牛源A.towneri、A.baumannii、A.johnsonii多重PCR检测方法的构建及应用针对A.towneri保守基因Omp A构建的特异引物,并参考文献报道A.baumannii（Ptk基因）、A.johnsonii（ITS基因）的特异性引物（序列分别为F5‘-CAGGTCCTGCGCCAAGTTG-3’,R 5‘-GATGCCATCCGTCACGGCTAAG-3’;F5‘-CATTATCACGGTAATTAGTG-3’,R 5‘-AGAGCACTGTGCACTTAAG-3’）,构建了上述三种菌的PCR检测方法。按2×Master Mix 25μL,dd H2O 8μL,A.johnsonii、A.baumannii和A.towneri的上下游引物量分别为1μL、0.5μL和4μL,模板量菌液分别为1μL、1μL和4μL;反应程序为94℃5 min;94℃1 min,50℃1 min,72℃1min,35cycle;72℃延伸10min;可分别获得365bp、208bp和401bp的特异性条带。经对45份患呼吸道疾病的肉牛鼻拭子进行A.towneri、A.baumannii、A.johnsonii的检测,检出率分别为6.7%（3/45）、11.1%（5/45）、4.4%（2/45）;与采用传统细菌分离A.towneri、A.baumannii、A.johnsonii的鉴定方法比较,其吻合度分别高达到100%、93.3%和100%。结论:1.首次从患呼吸道综合征病牛中分离到A.towneri,该菌对小鼠具有一定的致病性,主要损害脾脏、肺、心和肝等器官。2.针对A.towneri的Opm A基因,成功构建了A.towneri的单重PCR检测方法,以及其与A.baumannii、A.johnsonii的三重PCR检测方法。3.经与传统细菌分离鉴定方法验证,构建A.towneri的单重PCR与多重检测方法适用于肉牛临床呼吸道疾病鼻拭子样品的检测,具有检出快速、效率高的特点。
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