传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的雏鸡传染病,IBDV感染雏鸡后引起法氏囊萎缩,最终导致死亡。给世界商业化养鸡行业造成巨大损失。因此对IBD的流行病学调查及研制快速、准确的IBDV检测方法至关重要。本研究对华东区域传染性法氏囊病病毒流行株进行分离及生物学性状分析,结合单克隆抗体技术建立了IBDV双抗体夹心ELISA和胶体金试纸条检测方法,为今后IBD的综合防治提供帮助。试验一:华东区域传染性法氏囊病病毒流行株的分离及其生物学特性分析为了解华东区域近年来IBDV的遗传变异现状,从该地区近三年来IBD疫苗免疫失败鸡群中分离到7株IBDV,命名为J3、A4、S8、S9、A11、S14和J17。7株IBDV均能直接适应于鸡胚培养,但对CEF、DF-1以及DF-EGFP-miR-9三种细胞的适应性和细胞培养中的病毒滴度有显著差异,较易适应于DF-EGFP-miR-9细胞,A11毒株在DF-EGFP-miR-9细胞中的滴度高达1011TCID50/0.1ml。用第3代鸡胚毒分别感染6周龄SPF雏鸡,均表现出临床症状和死亡,发病率为100%,死亡率在500%～700%,而用第20代细胞毒感染的SPF雏鸡,均未出现临床症状和死亡。将7株IBDV分离毒vp2基因全长序列进行同源性分析,核苷酸和编码氨基酸序列的同源性分别为97.4%～99.6%和98.7%～99.8%。遗传进化分析,7株IBDV分离毒均属于血清Ⅰ型,分布在三个相对独立的超强毒力IBDV(vvIBDV)分枝中,特征性氨基酸位点表现出IBDV强毒株特性。在vp2第一亲水区,J17毒株有212N,S14毒株有222L,不同于其它强毒株或弱毒株。本研究结果表明,近年来,在华东区域IBD免疫失败的鸡群中流行着超强毒力wIBDV,毒株的生物学特性有明显差异,毒株的来源比较复杂,IBD的防控面临着新挑战。试验二:分泌传染性法氏囊病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立分别用纯化的传染性法氏囊病病毒和昆虫细胞表达的重组VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,利用单克隆抗体技术,制备脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经过筛选和克隆化,获得2株能稳定分泌传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4G8和2C9,抗体亚类分别为IgG2a和IgM。间接ELISA检测表明,2株单克隆抗体均只与IBDV VP2蛋白反应,而与其他4种禽类病毒及CEF细胞均无交叉反应,腹水效价分别为107和108。间接免疫荧光试验(IFA)证明,2株单抗均与传染性法氏囊病病毒细胞适应毒和重组VP2蛋白发生特异性反应;western blot分析表明,只有4G8能特异性识别传染性法氏囊病病毒和重组VP2蛋白的线性表位;病毒中和实验分析表明,单抗4G8腹水中和效价为107,单抗2C9无中和活性。试验三:传染性法氏囊病病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立本实验以mAb-2C9为捕获抗体,以HRP-4G8为标记抗体,经过条件优化,建立检测传染性法氏囊病病毒的单克隆抗体夹心ELISA方法。特异性试验证明,单克隆抗体夹心ELISA方法与实验室保存的四种禽病毒(NDV、AIVH9N2、IBV、EDSV)、CEF细胞和正常SPF鸡组织均无交叉反应;敏感性实验表明,应用所建立的方法对传染性法氏囊病病毒细胞适应毒的最低检出量为102.8TCID50;重复性试验表明,夹心ELISA方法同一批次内及不同批次间检测相同样品的变异系数均小于10%。实验结果表明,所建立的夹心ELISA方法特异性好、敏感性高、与其他方法符合率高,可用于传染性法氏囊病的临床诊断和流行病学调查。试验四:传染性法氏囊病病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测试纸条的制备用mAb-4G8作为金标记抗体,mAb-2C9作为检测抗体,根据建立的夹心ELISA方法制备传染性法氏囊病病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测试纸条。经过比较优化,确定胶体金溶液最适颗粒直径大小为20～30nm,最适pH为8.0,最适mAb-4G8工作浓度为18μg/mL,mAb-2C9最佳包被浓度为1.5mg/mL,质控抗体最佳包被浓度为1.0mg/mL。优化后的试纸条可特异性的与IBDV发生反应,敏感性实验表明,制备的胶体金可检测的最低病毒量为1039TCID50,重复性和稳定性较好,临床样品检测结果与夹心ELISA方法一致。本方法适用于传染性法氏囊病的现场检测。