前言：　　 目前，不论是通过外科的、经皮的或者经内窥镜方式的胆道引流，已经成为姑息治疗不可切除的恶性低位胆道梗阻的重要手段。特别是微创的经皮经肝或经内窥镜的胆道支架植入，在缓解黄疸症状、提高生活质量、延长生存期方面起到了积极的作用。然而，术后肠胆返流所致的支架堵塞和返流性胆管炎却一直影响着该项治疗的实际效果。因此，支架的开通就成为影响生存质量和治疗费用的重要因素。胆总管末端支架是否跨越壶腹部即Oddi括约肌(sphincter of Oddi，SO)功能的保留与否，也一直受到争议。　　 以往人们大多将研究焦点集中在胆总管末端植入支架后肠胆返流和支架梗阻的相关因素上，但支架对于SO及胆道压力的影响机制还不清楚。而且，胆总管末端支架植入后SO组织结构的变化以及肠胆返流的发生与程度也鲜有报道。因此，有必要从支架植入后胆道压力变化、SO组织病理学改变和肠胆返流的发生等方面对这些问题进行深入的研究。　　 本研究中，应用胆道测压、胆汁中99mTc-DTPA放射性活度与胰酶含量测定等方法，对动物模型及低位胆道梗患者支架植入前后的胆道压力与肠胆返流进行对比观察，并结合支架植入前后血常规和血液生化指标的变化，探讨支架植入后胆道压力的变化机制以及肠胆返流与返流性胆管炎的发生和原因。同时，应用VG染色和免疫组化的方法，观察动物模型胆总管末端支架植入后SO的病理变化，探讨一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)和血管活性肠肽(vasoactiveintestinal peptide，VIP)在SO组织中表达的变化和意义。从而进一步揭示胆总管末端支架植入后胆道压力和SO功能、组织病理变化的特性和机制，为肠胆返流所致的支架梗阻和胆道感染等并发症的防治开辟新的途径。　　 材料与方法：　　 一、动物模型胆道压力变化的研究1、实验动物随机选取由中国医科大学附属盛京医院动物实验中心提供的健康成年实验犬6只(雄性4只，雌性2只)，年龄2-4岁，体重22.5-30Kg。对实验犬胆总管末端支架植入前后相关指标进行自身对照比较。　　 2、仪器和设备(1)SHIMADZU SDU-500C型超声诊断仪及SHIMADZU2400(α)DSA设备。　　 (2)PC polygram HR高分辨、多通道胃肠功能测定仪及相应测压软件、三通道测压导管、低顺应性水灌注系统。　　 (3)日立7170A生化分析仪。　　 3、支架植入　　 实验犬在禁食水24小时后，经肌肉注射速眠新Ⅱ1.5-3.0ml行全身麻醉。首先在超声引导下确定胆囊位置，于超声监视下以5.0Fr胆道套管穿刺针经皮经肝穿刺胆囊，成功后在0.035inch导丝引导下将穿刺针外套管经胆囊管送入胆总管内，并留取胆汁10ml。在加硬导丝引导下，置换5.0Fr20cm动脉鞘于十二指肠内。沿动脉鞘插入测压导管至十二指肠远端内6-8cm，同时将动脉鞘退至胆总管上端，然后回撤导管测压。待测压后，在DSA透视下经由动脉鞘于胆总管末端行支架植入，支架为3mm×25mm的编织镍钛合金支架(北京安泰公司)，其远端5-10mm位于十二指肠内。抽尽胆囊胆汁，拔除动脉鞘后结束。术后给予青霉素160万U肌注，并继续禁食水24小时。5-6周后重复上述方法穿刺胆囊、留取胆总管胆汁，并插入测压导管经支架内送入十二指肠远端，回撤导管进行测压。　　 4、测压方法　　 设置电脑测压系统参数，水流速度为0.5ml/min，连接测压导管。待基线平稳后，匀速后拽导管经由壶腹部至胆总管内行测压并存储曲线。　　 二、动物模型SO组织变化的研究1、实验对象从胆总管末端支架植入前后成功测压的5只实验犬中随机选取4只，作为病理学检查的实验组。再从中国医科大学附属盛京医院动物实验中心随机选取健康成年实验犬3只(雌雄不限，年龄2-4岁，体重22.5-30Kg)，作为对照组。　　 2、药品和器材(1)一抗：血管活性肠肽抗体，一氧化氮合酶(诱导型)抗体；二抗：山羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)。　　 (2)5％BSA封闭液，SABC，复合消化液，DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。　　 (3)C-7070/BX41采集图像系统(Olympus，JP)。　　 (4)MetaMorph显微图像分析系统(Universal Imaging Corporation，USA)。　　 3、实验方法　　 (1)标本采集：实验犬经肌肉注射速眠新Ⅱ行全身麻醉。在无菌条件下经腹正中切口开腹，并逐层进入腹腔。夹闭十二指肠两端，游离胆总管，将含有支架的胆总管、壶腹部及一部分十二指肠一并取下。分离并留取壶腹部组织，放到4%多聚甲醛内固定。　　 (2)VG特殊染色：标本用甲醛浸泡，石蜡包埋，5μm连续切片；切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇后直至流水冲洗2min；苏木素染色15min，流水冲洗2min；盐酸乙醇分化10s(提插数下)；流水冲洗30min；VG染液染色5min；小心的用吸水纸将染液洗干，避免磨损组织；乙醇、二甲苯快速的脱水、透明，最后中性树脂封片固定。　　 (3)免疫组化：新鲜组织经4%多聚甲醛固定24小时，常规石蜡包埋，5μm连续切片，65℃烤25min；常规脱蜡至水；30%H2O2灭活内源性活化酶，浸泡10min后，蒸馏水洗3次；热修复抗原：将切片浸入0.01M构椽酸盐缓冲液(PH6.0)，微波炉加热至沸腾后断电，间隔10min后，反复2次。冷却后PBS洗涤2次；滴加5%BSA封闭液，室温20min。甩去多余液体，不洗；滴加适当稀释的一抗兔IgG，4℃过夜，PBS洗涤；滴加二抗生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育20min，PBS洗；0.05%DAB显色，镜下控制反应时间，流水冲洗终止反应；苏木素轻度复染，脱水，透明，树脂封片。阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤相同。　　 4、结果判断　　 观察NOS和VIP时，均以壶腹部SO平滑肌细胞、粘膜柱状上皮细胞和粘膜下结缔组织细胞的胞核蓝色，胞质棕黄色染色为阳性。每张切片选择5个视野，用40×物镜观察采集图像。对于每张图像，应用MetaMorph和C-7070/BX41显微图像分析系统测定其阳性区域的积分光密度值(integrated optical density，IOD)。　　 三、肠胆返流的研究1、受试对象随机选取2008年4月至2009年1月间，因恶性低位梗阻性黄疸在中国医大附属盛京医院介入病房住院治疗的患者16例(男性8例、女性8例)，年龄为51-86岁(平均69.63±9.16岁)。其中胆管癌4例、胰头癌5例、壶腹癌5例、转移癌2例。术前所有患者没有胆道感染的临床症状和体征，并排除肠梗阻及肠道手术病史。所有患者均通过经皮经肝胆管穿刺的方式，于胆总管末端植入金属网状支架。共植入17枚支架(15例各植入1枚，1例植入2枚)，直径为10mm，长度为50-80mm。在植入支架前进行血常规、血液生化检查和胆汁中胰酶含量的检测。在支架植入后2-5天(平均3.25±0.86天)进行上述各项指标和胆汁中放射性活度的检测。　　 2、支架植入　　 患者在超声引导下，以5.0Fr DLPN胆道穿刺针行经皮经肝胆道穿刺。成功后，在DSA监视下，应用导丝引导于梗阻部位近端置入6.0-8.0Fr的外引流管，行单纯外引流。待黄疸消退，经原有胆道外引流通路于胆道梗阻部位植入金属网状支架。并将引流管置于支架近端内l-2cm或其上端胆道内。术后2-5天内试验闭管并观察后，行经外引流管的胆道造影确认，口服核素并留取胆汁后拔管。　　 3、胆汁中核素的检测所有患者于造影拔管前禁食一夜。拔管前经造影确认引流管位置后，口服1ml含有185MBq(5mCi)核素99mTc-DTPA的水，接着250ml温水漱服，立即平卧位，经胆道引流管收集接下来2h的胆汁，取其中的20ml，采用RM905型放射活度检测仪计数放射性活度。测量之前测定本底的放射性活度，再测量装有待测胆汁的注射器内的放射性活度，两者的差值为最终胆汁内放射性活度。如果胆汁中可以检测到放射性活度，则认为该患者存在十二指肠胆道返流。　　 4、胆汁胰酶含量的检测胆道单纯外引流1-2天后，胆汁性状良好时留取20ml，进行支架植入前的胆汁脂肪酶和淀粉酶含量的检测。支架植入后，于拔管前经造影确认引流管位置后，留取胆汁20ml行胰酶含量检测。　　 5、血常规和血液生化检查于胆道穿刺引流前及支架植入后拔管前，分别检测外周血白细胞计数和中性粒细胞百分比以及血液生化中总胆红素和直接胆红素含量。　　 四、数据统计及处理对实验所获得的计量资料结果，符合正态分布的，以mean±SD表示，并采用t检验对数据进行比较；不符合正态分布的，则计算其中位数和25%、75%可信区间，采用Wilcoxon秩和检验对数据进行比较。P<0.05认为有统计学差异，P<0.01认为有显著的统计学差异。　　 结果：　　 一、动物模型胆道压力变化的研究1、实验动物6只实验犬全部一次穿刺成功，并于测压后植入支架。其中1只植入支架后5周发现支架脱落，再次植入支架时因胆汁瘘而死亡；其他5只均于观察时间内再次穿刺、测压，并健康存活。　　 2、胆道压力　　 胆总管末端支架植入前测得SOBP、CBDP、SOCA、SOD分别为：13.69±4.29mmHg、12.98±2.86mmHg、42.65±8.50mmHg、6.69±1.46s；支架植入5-6周后分别为：10.58±3.98mmHg、7.43±2.20mmHg、31.95±9.00mmHg、4.47±1.21s。其中SOBP和CBDP均高于DP，SOBP较支架植入前有所降低，但无统计学差异(P>0.05)；而CBDP明显低于支架植入前，具有显著的统计学差异(P<0.01)。SOCA较支架植入前降低；SOD相比支架植入前缩短。SOCA和SOD与支架植入前相比，均有统计学差异(P<0.05)。　　 3、肠胆返流　　 胆总管末端支架植入5-6周后，胆总管胆汁中的脂肪酶和淀粉酶含量分别为9.50±4.80U/L和43.00±6.48U/L，与支架植入前相比均没有显著的统计学差异(P>0.05)。　　 二、动物模型SO组织变化的研究1、VG特殊染色光镜下观察(10×物镜)，VG染色后平滑肌呈黄色，胶原纤维和结缔组织呈红色。胆总管末端植入支架后的实验组与正常对照组比较，可见SO有以下病理改变：　　 (1)纤维化：轻度者可见平滑肌中已含有少量胶原和结缔组织纤维。而重度者则可发现肌肉组织仅呈孤立小岛状，很难发现肌纤维束，周围大量胶原纤维和结缔组织，并伴有透明变性。　　 (2)腺体病变：可见腺体呈囊状扩张，腺肌病变即腺体进入平滑肌纤维及胶原纤维组织中被环绕。　　 (3)炎性病变：表现为炎性浸润，即腺体、肌肉和结缔组织间有淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞浸润。　　 2、免疫组化　　 (1)壶腹部SO粘膜层中NOS和VIP的IOD变化：实验组的NOS和VIP的IOD中位数分别为18.87和101.18，与对照组相比虽有增加趋势，但没有统计学差异(P>0.05)。　　 (2)壶腹部SO粘膜下层和粘膜肌层中NOS和VIP的IOD变化：实验组的NOS和VIP的IOD中位数分别为17.34和45.23，与对照组相比较没有统计学差异(P>0.05)。　　 (3)壶腹部SO肌层中NOS和VIP的IOD变化：实验组的NOS和VIP的IOD分别为12.18±5.87和77.85±51.75，与对照组比较没有统计学差异(P>0.05)。　　 三、肠胆返流的研究1、受试对象16例患者中，支架植入后有1例脱管、1例胆汁未引出而没有进行拔管前胆汁中放射性活度和胰酶含量的检测；其他14例患者均成功地进行了胆汁中放射性活度和胰酶含量的测定。　　 2、肠胆返流　　 在14例患者中有85.71%的患者(12/14例)2小时胆汁中检测到99mTc的放射性活度，所检测到的放射计数为3.36±2.82MBq，占总摄入剂量的1.82%。　　 支架植入前，测得胆汁中脂肪酶和淀粉酶含量的中位数分别为21.25U/L和10.5U/L。支架植入后，胆汁中脂肪酶和淀粉酶含量明显升高，其中位数分别达到了5902.45U/L和2991U/L，与支架植入前相比均有显著的统计学差异(P<0.01)。　　 3、血常规和血液生化在14例患者中，支架植入后均没有出现高热、寒战、黄疸加重等胆管炎表现。外周血中的白细胞计数为7.59±2.62×109/L，中性粒细胞百分比的中位数为73.55%，与支架植入前相比都没有统计学差异(P>0.05)。　　 支架植入前，血液生化中的总胆红素和直接胆红素值分别为216.84±138.05umol/L和168.55±103.28umol/L。支架植入后，总胆红素和直接胆红素值明显下降，分别为118.24±91.79umol/L和94.48±68.45umol/L，与支架植入前相比都具有显著的统计学差异(P<0.01)。　　 结论：　　 1、动物模型胆总管末端支架植入5-6周后，SO运动功能的减弱以紧张性收缩的减弱为主，而基础性收缩仍然存在。CBDP虽然下降，但仍高于正常的DP，并保持与之的压力梯度，抑制了肠胆返流的发生。　　 2、动物模型胆总管末端支架植入5周后，壶腹部SO肌层中发生了不同程度的纤维化、腺体病变和炎性反应等病理变化。免疫组化发现SO各层组织中NOS和VIP的表达并没有明显的改变。　　 3、低位胆道梗阻患者胆总管末端支架植入后，早期就有较高的肠胆返流发生率。但发生肠胆返流的同时并没有返流性胆管炎的出现。