昆虫飞行能力的获得大约发生在4亿年前,是昆虫适应性进化的重要里程碑。飞行能力使昆虫的运动能力得到极大拓展,有利于它们寻偶、避敌、觅食等,大大促进了昆虫的大范围扩散。然而,在进化过程中,许多原本具备飞行能力的昆虫又丧失了这种能力。Wollaston等曾记录了马德拉群岛上500种甲虫中的200种丧失了飞行能力。昆虫的一些类群,如蛩蠊目、蚤目等中的几乎所有昆虫都没有飞行能力。在竹节虫、蝗虫、蟋蟀、蠼螋等类群中,飞行能力丢失的现象也很常见。一些昆虫虽然具备翅膀的结构,但丧失了飞行能力,Roff等曾做过估算,大约有5%的有翅昆虫不具备飞行能力,一些昆虫甚至完全丢失了翅膀。总的来说,飞行能力的退化或丢失在昆虫中广泛存在。研究昆虫飞行能力退化的遗传机制对人类理解昆虫的适应性进化和防虫防控具有重要意义。家蚕（Bombyx mori）由野桑蚕（Bombyx mandarina）驯化而来,是唯一被人类完全驯化的昆虫,在基础科学研究领域,家蚕是鳞翅目昆虫的模式物种。在长期的人工选择过程中,家蚕飞行能力丢失使家蚕的大规模养殖和蚕种的制备等过程更容易操控,是人类利用昆虫的一个重要事件。长期以来,对家蚕经济性状、重要遗传突变的遗传机制和个体发育等的研究是家蚕基础研究的主要方向,而其飞行能力的丢失还鲜少有人关注。但作为一种重要的性状改变,家蚕飞行能力退化机制的解析是必要的,这个工作不仅能增进人们对家蚕驯化历史的认知,也能为昆虫飞行能力退化的研究提供参考,对解释昆虫适应性进化的遗传机制具有重要意义,并在鳞翅目害虫防控方面具有重要转化研究价值。与野桑蚕相比,家蚕形态性状在驯化过程中发生了较大的变化,哪些性状的变化导致家蚕飞行能力的退化?家蚕飞行能力的丢失是人类有意识的直接选择,还是人类在有意识提高其经济性状的过程中逐渐退化（功能约束放松）的?家蚕飞行能力的退化与哪些基因有关?这些基因在家蚕的驯化过程中发生了什么改变?这些问题至今仍未得到解答。本研究应用形态学、基因组生物信息学和功能基因组学的研究方法,对与桑蚕飞行相关的形态性状进行调查分析,并比较它们在野桑蚕和家蚕之间的差异。通过对全基因组进行正选择位点的检测,并对相关基因进行选择压力分析,结合转录组数据,筛选出与飞行能力退化相关的基因,利用RNAi等技术对重要有关基因的功能进行了分析和研究。主要结果如下:1.桑蚕飞行相关形态性状的调查和比较分析通过组织解剖、组织切片、高速摄像等方法,分别对家蚕和野桑蚕的翅面积、翅型、翅的机械性能（硬度）、翅负载（体重/翅面积）、振翅频率、振幅、飞行肌重、飞行肌的显微结构、飞行肌与身体的比率（飞行肌重/体重）等相关参数并进行了比较分析。我们发现家蚕和野桑蚕翅的机械性能、翅负载、振翅能力、飞行肌的显微结构、飞行肌比率等具有显著差异。进一步的分析结果显示,飞行肌的退化可能在家蚕飞行能力丢失过程中发挥了重要作用。通过比较分析了家蚕和野桑蚕飞行肌的线粒体数目和ATP含量,发现野桑蚕飞行肌的ATP含量是家蚕的3倍,说明能量供应不足可能是家蚕飞行能力丢失的重要原因。2.桑蚕全基因组的选择压力分析我们对135个家蚕和20个野桑蚕重测序数据进行全基因组的变异检测和分析,筛选到37,417,881个SNPs（Single Nucleotide Polymorphism）和10,183,483个INDELs（Insert and Deletion）变异。通过对家蚕全基因组进行选择性清扫分析,共鉴定到了397个有正选择信号的基因。对这些基因的NR（non-redundant database）注释结果进行分析,发现2个与肌肉发育相关的基因,7个与能量代谢相关的基因,1个与神经发育相关的基因和2个与细胞凋亡、细胞自噬相关的基因。肌肉发育相关基因为副肌球蛋白（paramysion）基因和Tintin基因,能量代谢相关的基因包括ATP合成酶、脂肪酸结合蛋白和糖原磷酸化酶等。3.家蚕和野桑蚕飞行肌的转录组分析通过解剖观察和对肌肉发育标记基因（β-actin）表达谱的分析,我们认为蛹6天（P6）是飞行肌发育的重要时期。对P6时期家蚕和野桑蚕转录组的分析显示,有6187个基因在家蚕和野桑蚕飞行肌中有表达差异,其中,3654个基因在家蚕中下调表达。功能富集分析显示,这些基因的功能主要富集到代谢通路（metabolic pathways）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、线粒体自噬（mitophagy）、细胞自噬（autophagy）、细胞凋亡（apoptosis）等通路中。化蛾第一天（M1）是蚕飞行肌的主要供能时期,转录组分析显示,有1422个基因在M1时期的家蚕和野桑蚕飞行肌中有表达差异,其中,723个基因在家蚕中下调表达。功能富集分析显示,这些基因主要富集在代谢通路（metabolic pathways）、柠檬酸循环（citrate cycle）、脂肪酸代谢（fatty acid metabolism）等通路中。说明柠檬酸代谢、脂肪酸代谢等通路相关的基因可能与家蚕和野桑蚕之间飞行肌的能量供应差异有关。P6和M1时期的这些差异基因中,Bmtitin2,Bmscu和Bmgs2基因具有明显的正选择信号。Bmtitin2是飞行肌相关的结构蛋白,Bmscu编码3-羟酰辅酶A脱氢酶（HOAD）,Bmgs2与神经递质和神经突触的组装有关。我们将这3个基因作为蚕飞行能力退化的候选基因。4.Bmtitin2、Bmscu和Bmgs2基因的核酸序列分析分别对家蚕和野桑蚕Bmtitin2、Bmscu和Bmgs2基因的蛋白编码序列和调控序列进行分析,发现家蚕3个基因的编码区与野桑蚕相比都没有能引起基因功能改变的变异。在调控区域,与野桑蚕相比,家蚕的Bmscu基因上游341bp和361bp处分别有两个P元件转座子的插入,插入长度分别为1343bp和2814bp。其中,361bp处转座子的插入在家蚕中具有普遍性,有该转座子插入的家蚕品系约占家蚕群体的83%,在野桑蚕群体中没有检测到该转座子的插入。说明该转座子的插入可能是在家蚕驯化过程中发生并经过人工选择逐渐固定的。在家蚕Bmgs2基因的上游序列中发现了多处家蚕特异的插入缺失,这些特异的插入缺失有可能影响该基因在家蚕中的表达。在Bmtitin2基因下游鉴定到20个等位基因频率在家蚕和野桑蚕之间有显著差异的SNP位点,这些位点的变异可能与该基因的转录后调控有关。5.家蚕飞行能力退化相关基因的功能验证分别对家蚕和野桑蚕Bmscu基因和Bmgs2基因的上游2kb序列进行了双荧光素酶报告基因实验,发现野桑蚕上游调控序列比家蚕上游调控序列具有更强的启动活性。在野桑蚕及家蚕与野桑蚕的杂交F1代个体中对Bmtitin2、Bmscu和Bmgs2基因进行RNAi,结果显示,干涉Bmscu和Bmgs2基因后,蚕蛾飞行的最大速度、平均速度等显著下降,停飞次数显著增加。这些结果说明,Bmscu基因和Bmgs2基因对蚕飞行能力的维持有重要作用。Bmscu编码3羟酰辅酶A脱氢酶（HOAD）,HOAD在脂肪酸beta氧化中具有重要作用,能催化脂肪酸氧化并释放大量ATP。将Bmscu在BmE细胞系中干涉后,发现HOAD的酶活性和ATP含量较对照组显著降低。这说明Bmscu基因的下调表达减少了ATP的生成,家蚕飞行肌中ATP含量的降低可能与Bmscu基因的下调有关。综上所述,我们得出如下结论:家蚕飞行能力的退化与其飞行肌的显微结构和能量供应有关;家蚕飞行能力的退化受到正选择作用,是人工选择的结果;Bmtitin2、Bmscu和Bmgs2基因在家蚕飞行肌中的表达显著低于野桑蚕,这种表达模式是由其上下游调控序列的变异导致的。Bmscu基因和Bmgs2基因的干涉影响了家蚕的飞行能力,说明它们的下调表达可能是家蚕飞行能力退化的原因。Bmscu的下调表达抑制了HOAD的酶活,且影响了家蚕中ATP的生成,说明该基因可能通过减弱脂肪酸β氧化的过程影响飞行肌的能量供应,从而影响家蚕的飞行能力。