研究背景:原发性肝癌作为我国常见的恶性肿瘤,位于我国肿瘤致死原因的第三位。其中肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)约占肝癌类型85%-90%。发病隐匿,早期没有典型症状,多数患者发现时已失去了根治性治疗的时机,因此,深入了解HCC发病的分子机制,有助于肿瘤的早期诊断及降低术后复发几率。长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸,并且没有蛋白质编码能力的RNA,随着研究的进展发现,大量的研究发现LncRNA能够调节基因表达来参与肿瘤的进程,成为潜在的肿瘤标志物与分子治疗靶点。CRNDE(Colorectal neoplasia differentially expressed)是最早被发现在结肠癌患者的癌组织中呈高表达的一种LncRNA,其具有组织表达特异性,在乳腺,睾丸,支气管及腮腺等部位高表达,促进肿瘤的增殖,与患者临床预后密切相关,但在肝癌中的作用机制仍不明确,有文献报道在肝癌中其可能参与细胞周期控制。CDK6(cyclin-dependent kinase 6,CDK6)是参与细胞周期调控的重要蛋白,研究发现,CDK6的失衡会影响细胞的周期进程,从而调节肿瘤细胞的增殖。通过生物信息学分析,我们发现,miR-33a-5p与CRNDE存在靶基因关系;同时miR-33a-5p与CDK6也存在结合位点。在肝癌中,CRNDE可能通过调控miR-33a-5p影响CDK6的表达,进而调控肿瘤的增殖,可能成为肝癌治疗的潜在靶点。研究目的:1、检测LncRNA CRNDE在肝癌组织中的表达情况,明确其与临床病理特征的相关性;2、研究CRNDE/miR-33a-5p/CDK6轴调控HCC增殖的作用机制。方法与结果:1.通过检测30对肝癌及癌旁组织中LncRNA CRNDE的表达情况,结果表明,肝癌组织中CRNDE表达明显高于癌旁组织,根据PCR结果将30个肝癌患者分为高表达组和低表达组,CRNDE高表达与肿瘤TNM分期、是否存在微血管侵犯密切相关。2.通过GEPIA数据分析发现,在肝细胞肝癌中,CRNDE高表达患者的总体生存期短于CRNDE低表达患者的总体生存期。利用30例临床患者资料,发现LncRNA CRNDE、微血管浸润是肝癌患者不良预后的独立因素。3.通过沉默Huh-7细胞中CRNDE的表达,发现CRNDE的下调显著抑制肝癌细胞Huh-7的增殖、迁移及侵袭。4.利用双荧光酶素检测发现共转染miR-33a-5p与包含野生型CRNDE的双荧光素酶报告基因载体可引起报告基因荧光强度明显下降,另外下调CRNDE表达的Huh-7细胞,其miR-33a-5p表达明显升高,表明CRNDE靶向作用于miR-33a-5p,并下调其在肝癌中的表达,从而发挥作用,为进一步验证此结果,我们通过qRT-PCR检测了30对肝癌、癌旁组织,以及对肝癌细胞进行了检测,发现miR-33a-5p在癌组织及肝癌细胞中低表达。过表达miR-33a-5p抑制肝癌细胞Huh-7的增殖。5.为验证CRNDE通过CRNDE/miR-33a-5p/CDK6轴在HCC中发挥作用,我们发现通过双荧光酶测定法将miR-33a-5p与野生型CDK6共转染双荧光酶素报告载体可导致报告基因的荧光强度明显下降,说明miR-33a-5p可以与CDK6结合,通过Western Blot检测发现,CDK6在癌组织表达明显高于癌旁组织,肝癌细胞Huh-7中的表达也明显高于正常人肝细胞L02中的表达。而通过下调CRNDE或过表达miR-33a-5p可以明显降低CDK6的表达,说明CRNDE及miR-33a-5p为CDK6的上游,进一步过表达CDK6发现,过表达CDK6可以明显促进Huh-7细胞的增殖,并且其作用可以被miR-33a-5p mimics所抵抗,说明CRNDE可以通过调控CDK6促进肝癌细胞的增殖。6.为了研究CRNDE和miR-33a-5p在体内的作用,我们通过注射sh-CRNDE,miR-33a-5p mimics及其空转染组转染的Huh-7细胞建立异种移植小鼠模型。a结果表明sh-CRNDE和miR-33a-5p mimics组显著抑制肿瘤生长,肿瘤体积减少。结论:1.LncRNA CRNDE在肝细胞肝癌组织中过表达,与肿瘤TNM分期、是否存在微血管侵犯显著相关,与患者预后相关,是患者预后的独立因素;2.LncRNA CRNDE通过CRNDE/miR-33a-5p/CDK6轴促进肝癌的增殖,它可能成为肝细胞肝癌的新肿瘤标志物和分子生物治疗靶点。