论文部分内容阅读
目的:支气管肺发育不良(BPD),是一种严重威胁早产儿健康的呼吸系统并发症。既往研究证实巨噬细胞内NLRP3炎症小体的激活,与炎症肺损伤和BPD发生关系密切。敲除NLRP3基因可缓解LPS、高氧BPD模型动物肺部炎症,并改善肺泡简单化等BPD表现。在临床上枸橼酸咖啡因可降低呼吸暂停早产儿BPD发病率,但其作用机制并不明确。近期研究发现咖啡因具有一定抗炎作用,可抑制包括IL-1β在内多种炎症介质释放。咖啡因抗炎是否与抑制巨噬细胞NLRP3炎症小体激活有关,目前缺乏直接研究。因此本课题拟利用体外构建的LPS诱导THP-1巨噬细胞NLRP3炎症小体激活模型,探究咖啡因对巨噬细胞NLRP3炎症小体激活的影响,并初步探索其作用机制。为明确咖啡因抗炎相关机制提供一定依据,也为基于NLRP3炎症小体抑制作用的BPD预防药物研发提供新思路。方法:1.建立LPS诱导THP-1巨噬细胞NLRP3炎症小体激活模型与咖啡因安全性评估PMA诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞。不同浓度LPS处理后,RT-PCR和western blot检测NLRP3基因转录与蛋白表达。不同浓度咖啡因处理细胞后,流式细胞术检测细胞凋亡率,western blot检测caspase3活化水平。2.明确咖啡因对LPS/ATP诱导THP-1巨噬细胞IL-1β和IL-18分泌的影响。不同浓度咖啡因预处理后,在LPS/ATP诱导的THP-1巨噬细胞中,ELISA法检测细胞培养上清中IL-1β和IL-18的分泌量,RT-PCR检测IL-1β和IL-18基因转录水平。3.验证咖啡因对LPS/ATP或LPS/Nigericin诱导THP-1巨噬细胞NLRP3炎症小体激活的抑制。不同浓度咖啡因预处理后,LPS/ATP或LPS/Nigericin诱导THP-1巨噬细胞NLRP3炎症小体激活。RT-PCR和western blot检测NLRP3、ASC、caspase1基因转录与蛋白表达,并检测caspase1活化水平,免疫荧光观察ASC斑块形成。4.评估咖啡因对LPS诱导THP-1巨噬细胞中MAPK/NF-κB通路活性的作用。不同浓度咖啡因预处理后,LPS激活THP-1巨噬细胞中MAPK/NF-κB信号通路。RT-PCR和ELISA检测TNF-α与IL-6基因转录和分泌,western blot检测MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白磷酸化水平,并通过免疫荧光观察p65核转位。5.验证咖啡因对LPS/ATP诱导THP-1巨噬细胞中A2aR诱导ROS生成的抑制。在LPS/ATP诱导的THP-1巨噬细胞中运用siRNA干扰A2aR表达,RT-PCR和western blot检测干扰效果。western blot检测siRNA干扰后LPS/ATP诱导的THP-1巨噬细胞NLRP3炎症小体激活,流式细胞术检测胞内ROS生成量。不同浓度咖啡因预处理后,LPS/ATP共处理THP-1巨噬细胞,RT-PCR和western blot检测A2aR基因转录与蛋白表达水平,流式细胞术检测胞内ROS生成量。结果:1.THP-1单核细胞经50nM PMA过夜诱导后多数分化为巨噬细胞。THP-1巨噬细胞经1μg/ml LPS诱导3h后,NLRP3转录与翻译水平显著上升。咖啡因浓度在低于800μM时,不会引起显著的细胞凋亡。2.LPS/ATP可诱导THP-1巨噬细胞IL-1β和IL-18的分泌。咖啡因预处理后,可呈浓度依赖性抑制IL-1β转录和IL-1β与IL-18的分泌。3.咖啡因预处理可显著降低LPS/ATP诱导的THP-1巨噬细胞NLRP3基因转录与蛋白表达。尽管咖啡因对ASC和caspase1基因转录和蛋白表达无明显影响,但可抑制ASC斑块形成和Caspase1的活化。4.在LPS诱导THP-1巨噬细胞中,咖啡因预处理可降低MAPK通路中JNK、ERK与p38和NF-κB通路中IκB-α与p65的磷酸化水平,并可抑制p65入核。5.在LPS/ATP诱导的THP-1巨噬细胞中,A2aR siRNA有效抑制A2aR基因转录和蛋白表达,并可抑制caspase1活化和ROS生成。咖啡因呈剂量依赖性抑制LPS/ATP诱导的A2aR基因转录与蛋白表达,并降低胞内ROS生成。结论:结果表明,咖啡因可抑制LPS诱导的THP-1巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活,抑制IL-1β与IL-18分泌。在此过程中,咖啡因可抑制MAPK/NF-κB信号通路的活性,并可通过拮抗A2aR降低胞内ROS含量。