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胰腺导管癌是一种恶性程度高、病程短、进展快、预后极差的恶性肿瘤,具有复杂的基因组环境。KLF2是Krüppel样因子家族的重要成员,文献报道在多种恶性肿瘤组织中表达下调,与恶性肿瘤关系密切。但是KLF2与胰腺癌的关系未见报道,关系不明确,结合既往研究我们推测KLF2可能协同其他分子参与异常信号通路调节,导致胰腺癌发生、发展。本研究旨在探讨KLF2对胰腺癌细胞生物学行为影响及其机制。第一部分KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响研究目的探讨KLF2对胰腺癌细胞生长、迁移、体内转移和衰老的生物学行为影响。研究方法免疫组化法、Western Blot、RT-PCR法对52例胰腺导管癌组织和配对正常胰腺组织KLF2水平进行检测,观察胰腺癌组织KLF2表达变化,探讨KLF2与胰腺癌发生的关系。真核表达载体转染KLF2至BXPC3和Suit2细胞株,构建稳定生长过表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞;RNA干扰的病毒载体感染细胞株,构建稳定生长并低表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞。Boyden chamber实验检测过表达和低表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞的迁移能力,结晶紫法检测过表达和低表达KLF2细胞的增殖生长能力。Lipofectamine 2000载体转染HPAC细胞和SW1990,构建稳定生长的过表达KLF2细胞;RNA干扰病毒载体感染HPAC细胞和SW1990,构建稳定生长的低表达KLF2细胞。SA-β-gal染色检测过表达和低表达KLF2对HPAC和SW1990细胞衰老影响。荧光素酶基因标记低表达KLF2的BXPC3细胞注入裸鼠心脏,检测肿瘤转移光子数变化;裸鼠皮下种植过表达KLF2的SW1990细胞,测定肿瘤大小计算肿瘤体积,处死小鼠测肿瘤重量;观察KLF2表达对肿瘤体内生长和转移的影响。分离PDX-Cre KrasG12D（KC）小鼠胰腺组织,建立胰腺癌类器官,Lipofectamine 2000作为载体建立过表达KLF2的类器官,体外观察过表达KLF2对胰腺癌类器官生长影响。研究结果与正常胰腺组织相比,胰腺导管癌组织中KLF2 m RNA水平下降、KLF2免疫组化染色阴性增多、KLF2蛋白水平下调。敲减KLF2的BXPC3和Suit2细胞克隆形成和迁移能力增强,低表达KLF2的HPAC细胞和SW1990衰老细胞比例减少,低表达KLF2的BXPC3细胞在裸鼠体内转移光子信号更多。高表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞的克隆形成和迁移降低;高表达KLF2的HPAC和SW1990细胞衰老细胞比例更高;高表达KLF2的SW1990细胞裸鼠皮下移植瘤体积更小、重量更轻。高表达KLF2的胰腺癌类器官生长大小更小、数量少。研究结论KLF2低表达与胰腺导管癌发生相关。KLF2高表达能够抑制胰腺癌细胞体外生长、迁移和体内生长转移,并诱导细胞衰老,抑制胰腺癌干细胞生长;KLF2低表达能够促进胰腺癌细胞体外生长、迁移和体内生长转移,并抑制细胞衰老。第二部分KLF2抑制胰腺癌的机制研究研究目的探讨KLF2调控胰腺癌细胞生长、迁移、体内转移和衰老等生物学行为改变的机制。研究方法采用报告基因检测法分析过表达KLF2对β-catenin/TCF转录活性及其信号通路下游部分靶基因影响,探讨KLF2通过调控β-catenin/TCF信号抑制胰腺癌机制。Western Blot法及q PCR法测定KLF2变化对细胞衰老标记物p21蛋白及m RNA表达变化,阐明KLF2通过诱导胰腺癌细胞发生衰老抑制胰腺癌。免疫沉淀后质谱法鉴定KLF2的结合蛋白,纯化GST-KLF2融合蛋白进行GST pull-down实验,探讨内源性FOXO4与KLF2的相互作用;免疫共沉淀检测外源性FOXO4是否与KLF2形成复合物,探讨外源性FOXO4与KLF2的相互作用。敲减FOXO4检测KLF2变化,结合敲减KLF2检测FOXO4变化,Western Blot法检测过表达和低表达KLF2、FOXO4对p21表达影响,SA-β-gal染色检测过表达和低表达KLF2、FOXO4对细胞衰老影响,探讨KLF2与FOXO4通过调控衰老抑制胰腺癌机制。过表达KLF2的HPAC细胞分别敲减FOXO4或p21,SA-β-Gal染色软琼脂实验观察衰老细胞克隆形成,观察敲减FOXO4和p21对细胞衰老的挽救作用。芯片实验检测KLF2和FOXO4与p21启动子的结合,Flag分别标记KLF2的AD、ID和ZF结构域后转染SW1990细胞,免疫沉淀Western Blot法检测KLF2与FOXO4结合的结构域,定位KLF2发挥抑制功能的结构区域。研究结果KLF2过表达可抑制氯化锂（Li Cl）诱导的Topflash报告基因激活,KLF2过表达可与β-catenin/TCF结合直接抑制其转录活性,也可下调β-catenin/TCF下游c-Jun、c-Myc、cyclin D1和Snail基因表达,抑制β-catenin/TCF信号通路。过表达KLF2诱导衰老特异标记物p21蛋白和m RNA水平显著升高;敲减KLF2后的胰腺癌细胞衰老减少,p21蛋白和m RNA水平降低。KLF2可与内源性FOXO4相互作用,与外源性FOXO4形成复合物,KLF2和FOXO4可通过与p21启动子结合协同诱导p21蛋白表达,共同诱导胰腺癌细胞衰老。敲减FOXO4和p21对KLF2诱导细胞衰老具有挽救作用。KLF2的AD区介导KLF2与FOXO4的相互作用,ID和ZF不能协同FOXO4诱导p21的表达,并且与FOXO4的共表达可能抑制FOXO4单独诱导p21表达作用,提示ID和ZF突变体为负调节因子。研究结论KLF2可直接与β-catenin/TCF结合抑制其转录活性、也可通过抑制其下游基因表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路后抑制胰腺癌。KLF2还可直接诱导p21表达,或与FOXO4结合协同诱导p21表达,诱导胰腺癌细胞衰老抑制胰腺癌。KLF2结构域的AD区与FOXO4绑定起正调节作用,ID和ZF突变体与FOXO4结合起负调节作用。调低FOXO4和p21表达能挽救KLF2诱导的胰腺癌细胞衰老。